登革Ⅱ型病毒E蛋白Ⅰ、Ⅱ結構域在大腸桿菌中的表達及免疫反應性鑒定＊

付宇姣，鄭學禮

登革病毒（DENV）屬于黃病毒科黃病毒屬，是最常見的通過節肢動物（伊蚊）傳播的病毒性疾病病原體，分布于全球100多個國家，特別是熱帶和亞熱帶地區［1］。全球大約有25億人受登革病毒感染的威脅，每年大約有5 000萬人感染登革熱，其中大約有210萬的嚴重病例，50萬例登革出血熱，20 000例死亡病例。登革病毒感染引起的病變范圍很廣，從自限性疾病到嚴重危及生命的登革熱、登革出血熱以及登革休克綜合征［2－4］。登革熱／登革出血熱已成為熱帶地區最為重要的蚊－傳播病毒性疾病，是重要的公共衛生問題［5］。

登革病毒是一個正義單鏈RNA病毒。登革病毒基因組RNA編碼3個結構蛋白（C、E、prM／M）和7個非結構蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5），分為4個典型的血清型（DENV1－4）。包膜糖蛋白E是主要的病毒顆粒包膜糖蛋白，以同源三聚體形式存在于成熟病毒顆粒表面。結晶學的研究表明，登革病毒的包膜糖蛋白E與其他黃病毒類似，分為3個結構域（Ⅰ－Ⅲ）［6－9］。在三個結構中，β鏈形成的二級結構是其主要結構。結構域I位于E蛋白單體中央，E蛋白II區折疊成長的指樣結構，E蛋白C端的氨基酸殘基構成了結構域Ⅲ。因為在所有成熟具有感染性的黃病毒中E蛋白均是由與病毒融合有關的同源二聚體形成，推斷E蛋白的所有結構都可能和病毒與細胞的融合過程有關［10］。其中E蛋白II區中第98～111位氨基酸殘基組成的cd環，富含甘氨酸且具有很強的疏水性，序列組成在幾乎所有的蟲媒黃病毒中高度保守。最近研究發現，cd環可在E蛋白由二聚體向三聚體的轉變過程中插入胞膜，參與病毒與宿主細胞膜的融合，被認為是病毒融合靶點，或認為是潛在的病毒融合肽［11－12］。推斷第一、第二結構域可能與登革病毒發病機制相關。本研究旨在從大腸桿菌中表達登革II型病毒包膜糖蛋白（E）的第一、二結構域（DI，DII），并通過免疫印跡驗證重組蛋白的免疫原性，為后續的功能研究奠定工作基礎。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

1．1．1 病毒株、菌株和質粒 登革Ⅱ型病毒NGC株、大腸桿菌DH5ɑ、表達菌BL21（DE3）、表達載體質粒pET－28a（＋）為本實驗室保存。

1．1．2 主要試劑、耗材 RT－PCR試劑盒、DNAMarker、限制性內切酶等購自大連寶生物工程有限公司；質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自美國O－mega公司；PVDF膜購自millipore公司；Trizol試劑、His·Tag單抗、增強型HRP－DAB底物顯色試劑盒購自英韋創津公司；HRP標記的羊抗小鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；登革病毒單抗（D1－11）購自美國Santa Cruz生物技術公司；預染雙色蛋白質標準購自美國Bio－Rad公司。

1．1．3 實驗動物 實驗用1～3日齡昆明乳鼠購自南方醫科大學實驗動物中心。

1．2 方法

1．2．1 引物的合成 引物用Premier 5．0軟件設計引物并由生工生物工程（上海）有限公司合成。RT－PCR擴增E蛋白第一，二結構域（DⅠ，Ⅱ）基因片 段 的 引 物：DV2－E－F：5′－CGTCCATATGATGCGTTGCATAG－3′（下劃線部分為NdeⅠ酶切位點 ），DV2－E－R：5′－TCGCCTCGAGTTATCCTTTAGAGC－3′（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點）。

1．2．2 乳鼠腦內接種病毒傳代 取－70℃保存的登革Ⅱ型病毒，加入DMEM培養基稀釋作為病毒液。用微量注身器每只30μL顱內接種1～3d齡昆明乳鼠。接種后5～9d期間的發病瀕死乳鼠拉頸處死，無菌取腦組織備總RNA的提取。

1．2．3 目的基因的獲得 發病乳鼠腦組織的總RNA提取參見Invitrogen公司的Trizol說明書。E蛋白第一、二結構域基因片段的擴增參見TaKa－Ra公司的RT－PCR試劑盒說明書。反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性45s，58．1℃退火60 s，72℃延伸120s，30個循環；72℃延伸8min。反應后擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測擴增片段的長度。

1．2．4 目的基因的克隆及重組表達質粒的構建將目的基因的PCR產物經切膠回收純化后與經XhoⅠ及NdeⅠ酶切純化的表達載體pET28a（＋），按照TaKaRa公司T4DNA ligase試劑盒說明書連接目的片斷與表達載體，連接產物轉化DH5α感受態細胞，置37℃培養12～16h挑取單菌落，采取菌落PCR法初篩陽性克隆質粒，提取質粒并進行雙酶切鑒定，將陽性克隆質粒送上海英俊生物工程有限公司測序，檢查連入的片段有無堿基突變及開放讀碼框是否正確。測序正確的質粒命名為pET28a－DV2－E－D1＆2。

1．2．5 重組質粒轉化BL21（DE3）感受態細胞及誘導表達的SDS－PAGE分析 測序正確的pET－28a（＋ ）－DV2－E－D1＆2，pET－28a（＋ ），轉 化 BL21（DE3）感受態細胞，挑取單菌落于終濃度為50mg／L卡那霉素的LB培養基中，37℃振蕩培養至OD600為0．5，取部分菌液作為誘導前對照，剩余菌液加入IPTG至終濃度為1mmol／L，37℃振蕩培養3h后收集菌液，沉淀，經12%分離膠的SDS－PAGE分析重組菌的誘導表達。

1．2．6 重組蛋白的可溶性分析及純化 菌體沉淀重懸于裂解緩沖液中冰浴超聲裂解至澄清，裂解菌液離心后，回收上清及沉淀并加入等體積的裂解緩沖液重懸沉淀，分別取等體積的上清與重懸沉淀經12%分離膠的SDS－PAGE分析重組蛋白的可溶性，重組蛋白的純化步驟參見德國Novagen公司的Ni－NTA His·Bind樹脂說明書。

1．2．7 Western blot鑒定重組蛋白誘導前后的重組菌全菌蛋白 重組蛋白經12%SDS－PAGE分離后，半干轉印于 PVDF 膜上，0．3%Tween－20，1%BSA封閉1h后，分別加入1∶3 000稀釋的His·Tag單抗和1∶500稀釋的登革病毒單抗于37℃孵育1．5h，PBST洗膜3次，加入1∶500稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG于37℃孵育1h，PBST充分洗膜后按照增強型HRP－DAB底物顯色試劑盒說明書顯色。

2 結 果

2．1 以提取的乳鼠總RNA經過RT－PCR擴增得到約900bp的E蛋白第一、二結構域基因片段，見圖1。

圖1 E蛋白第一，二結構域基因片段的PCR擴增Fig．1 PCR amplification of the envelop protein DNA fragmentLane 1：Products of PCR amplification M：DL－5000marker

2．2 pET28a－DV2－E－D1＆2載體的構建 重組質粒pET28a－DV2－E－D1＆2經XhoⅠ和 NdeⅠ雙酶切后，可見約900bp的酶切片段，與預期大小相符，見圖2。測序分析表明，插入序列正確且開放讀碼框正確。

2．3 重組菌誘導表達的SDS－PAGE分析 重組菌BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2經IPTG誘導后在37kD位置有明顯的誘導后表達帶，其大小與預測值一致。超聲裂解重組菌后，分別取上清與沉淀經12%SDS－PAGE分析，顯示重組蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中，見圖3。

2．4 Western blot鑒定重組蛋白 Western blot結果顯示，重組菌誘導前的全菌蛋白沒有與His·Tag單抗反應的條帶，而誘導后的全菌蛋白和在相對分子質量為37000的位置均有與His·Tag單抗反應的特異條帶，見圖4。登革病毒單抗（D1－11）與重組誘導前的全菌蛋白無反應，只在誘導后的全菌蛋白中有特異的條帶出現，且與預測的相對分子質量為37000的位置相符合，見圖5。上述結果說明，重組蛋白具有良好的免疫反應性。

圖2 重組質粒pET－28a－DV2－E－D1＆2的酶切鑒定Fig．2 Identification of the recombinant plasmid pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2by restriction enzymes digestionLane 1，3：Recombinant plasmid pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2；Lane 2，4：Recombinant plasmid pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2digested by the restriction enzymes XhoⅠ／NdeⅠ；M ：DL－5000Marker

圖3 BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2重組菌表達的 SDS－PAGE 分析Fig．3 SDS－PAGE analysis the expression of BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2Lane 1：BL21（DE3）／pET－28a（＋）before induction；Lane 2：BL21（DE3）／pET－28a（＋）after induction；Lane 3：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 before induction；Lane 4：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 after induction；Lane 5：Supernatant of BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2after sonication；Lane 6：Pellet of BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2after sonication；Lane 7：Purification of the recombinant protein DV2－E－D1＆2with Ni－NTAHis·Bind Resin；M：Protein marker

圖4 His·tag單克隆抗體鑒定重組DENV－2－E－D1＆2蛋白Fig．4 Western Blot identification of recombinant protein with His·Tag McAbLane 1：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 after induction；Lane 2：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 before induction；M：Prestained Protein marker

圖5 Dengue Virus（D1－11）的單克隆抗體鑒定重組DENV－2－E－D1＆2蛋白Fig．5 Western blot identification of recombinant protein with DENV（I－IV）McAbLane 1：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 after induction；Lane 2：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 before induction；M：Prestained Protein marker

3 討 論

登革病毒包膜蛋白E是由494～501個氨基酸殘基組成、分子質量約為55～60kDa的糖蛋白。E蛋白可形成3個不同的結構域，即呈β桶狀的I區，參與二聚體形成的II區和具有免疫球蛋白樣結構的III區。硫酸乙酰肝素（HS）是廣泛存在于細胞表面的一類由二糖重復單位組成的多糖，表面具有大量負電荷，具有包括介導病原體吸附等在內的多種生物學功能。研究表明，登革2型病毒中含高度保守的堿性氨基酸Lys89，Lys122，Lys123，其中I區和II區中帶有大量的正電荷Arg和Lys可能有助于病毒與硫酸乙酰肝素結合。研究也發現，將細胞表面的硫酸乙酰肝素脫硫或經酶消化去除后，登革病毒和黃熱病毒與細胞的結合能力顯著降低［13］。推斷第一、第二結構域可能與登革病毒發病機制相關。

本研究中重組表達的蛋白經SDS－PAGE分析以包涵體的形式存在。分析其形成原因有以下幾方面：蛋白表達量過高；重組蛋白含巰基酸多；重組蛋白所處發酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點，這些因素均可導致降低蛋白的溶解度，形成包涵體。

本研究成功地在大腸桿菌中表達登革II型病毒包膜糖蛋白（E）的第一、二結構域（DI，DII），對其進行免疫反應性鑒定，鑒定結果表明其具有良好的免疫反應性。為進一步研究第一、二結構域與宿主細胞的相互作用和功能及其致病性奠定了基礎。

［1］Henchal EA，Putnak JR．The dengue viruses［J］．Clin Microbiol Rev，1990，3（4）：376－96．

［2］Guzman MG，Halstead SB，Artsob H，et al．Dengue a continuing global threat［J］．Nat Rev Microbiol，2010，8（12Suppl）：7－16．

［3］Whitehorn J，Farrar J．Dengue［J］．Br Med Bull，2010，95（1）：161－73．

［4］Tapia－CR，Méndez－Galván JF，Gallardo－Rincón H．The growing burden of dengue in Latin America［J］．Clin Virol，2009，46（2 Suppl）：3－6．

［5］雷子慶，蘇裕心，鄭學禮．登革域型病毒E蛋白第三結構域在大腸桿菌中的表達、純化及免疫反應性鑒定［J］．南方醫科大學學報，2010，30（7）：1496－1499．

［6］Zhang W，Chipman PR，Corver J，et al．Visualization of membrane protein domains by cryo－electron microscopyof dengue virus［J］．Nat Struct Biol，2003，10（11）：907–912．

［7］Kuhn RJ，ZhangW，Rossmann MG，et al．Structure of dengue virus：implications for flavivirus organization，maturation，and fusion［J］．Cell，2002，108（5）：717－725．

［8］Modis Y，Ogata S，Clements D，et al．Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusion［J］．Nature 2004，427（6972）：313－319．

［9］Megret F，Hugnot JP，Falconar A，et al．Use of recombinant fusion proteins and monoclonal antibodies to define linear and discontinuous antigenic sites on the dengue virus envelope glycoprotein［J］．Virology，1992，187：480－491．

［10］Kuhn RJ，Zhang W，Rossman MG，et al．Structure of dengue virus：implications for flavivirus organization，maturation，and fusion［J］．Cell，2002，108（5）：717－725．

［11］Zheng A，Umashankar M，Kielian M．In vitro and in Vivo studies identify important features of dengue virus pr－E protein interactions［J］．PLoS Pathog，2010，6（10）：e1001157．

［12］Lin SR，Zou G，Hsieh SC．The helical domains of the stem region of dengue virus envelope protein are involved in both virus assembly and entry ［J］．Journal 0fVirology，2011，85（10）：5159－5171．

［13］秦鄂德，秦成峰，姜濤．登革病毒與登革病毒病［M］．北京：科學出版社，2008：28－34．