登革2型病毒E基因的表達及應用于血清學檢測

張志珊，嚴延生，翁育偉

登革熱是由登革病毒引起的急性蟲媒傳染病，廣泛流行熱帶、亞熱帶地區，100多個國家有地方性登革熱傳播，每年均出現幾百萬病例，其中以東南亞國家最為嚴重。我國東南沿海一帶長期有輸入性病例，且由此引起的本地暴發流行越來越頻繁，加強登革病毒的實驗室檢測，對于控制傳染源，減少疾病的傳播起著至關重要的作用。

目前登革熱的實驗室診斷主要包括病毒分離、基因診斷技術和血清學檢測。由于登革熱的病毒血癥期很短，因此病毒分離和基因診斷受到標本采集時間的限制，同時對設備、實驗室條件及人員素質要求很高，不利于推廣。ELISA法、免疫層析法具有較高的敏感性和特異性，且操作簡便快速，是檢測登革熱感染的主要方法。目前國內大多數實驗室主要采用澳大利亞Panbio公司生產的檢測試劑盒，但其價格昂貴，一般實驗室難以承受，且運送時間長，難以應對突發事件。而國內商業化的試劑盒其靈敏度和特異性大多不夠理想。本文采用原核系統表達登革2型病毒外膜蛋白基因，重組蛋白應用于血清學檢測，為進一步開發登革熱血清學檢測試劑盒打下基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 病毒株、細胞及血清來源 登革熱病毒2型（NGC株）、C6／36細胞、登革病毒2型感染者血清、日本腦炎IgG陽性血清由福建省疾病預防控制中心提供。

1．1．2 質粒和主要試劑 表達載體pET30a、大腸桿菌BL21（DE3）福建省疾病預防控制中心保存，大腸桿菌DH5α購自TaKaRa公司。RPMI1640細胞培養液購自Gibco BRL公司，病毒RNA提取試劑盒、一步法RT－PCR試劑盒購自QIAGEN公司。Taq DNA聚合酶、限制性內切酶、T4連接酶購自TaKaRa公司。用于血清檢測的酶標板條、酶標二抗由萬泰公司提供。參比試劑為澳大利亞Panbio生產的IgG捕獲法ELISA檢測試劑盒。

1．2 方法

1．2．1 病毒的增殖及核酸的提取 C6／36細胞在PRMI1640培養液（含10%胎牛血清，pH7．0）中于33℃、5%CO2條件下培養至單層后，接種病毒，靜置吸附1h后，加入維持培養液（含2%胎牛血清，pH7．0），培養3d后收集上清，按操作說明書進行核酸提取。

1．2．2 目的片段的擴增 參考GenBank公布的登革熱病毒2型序列（AF038403）設計1對引物用于擴增登革2型E蛋白去除C端疏水區的基因片段。正向 引 物：5′－GTGAATTCATGCGTTGTATTGGAATATCA－3′（劃線部分為引入的EcoRⅠ酶切位點），反向引物：5′－GATCTCGAGGAACATTTG－GCCGATTGAG－3′（劃線部分為引入的XhoⅠ酶切位點）。PCR反應體系：5×buffer 10μL，dNTP 2 μL，正、反向引物各2μL，Onestep RT－PCR Enzyme 2μL，RNA 5μL，加水至50μL。按下列程序進行擴增：50℃30min，95℃15min，然后94℃40s，55℃40s，72℃2min，進行30循環，最后72℃延伸10min。

1．2．3 表達載體的構建 擴增產物用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后與表達載體pET30a連接，轉化DH5α，涂布含有30μg／mL卡那霉素的LB平板，37℃過夜培養后，挑取單個菌落，接種LB（含30μg／mL卡那霉素）過夜培養后，提取質粒，用BamHI／XhoI雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的重組克隆重組克隆命名為pET30a－DEN2，用雙脫氧終止法進行DNA序列測定，應用DNASTAR中的EditSeq和SeqMan軟件對插入片段的序列進行分析。

1．2．4 重組蛋白的初步表達 鑒定正確的重組載體及pET30a空載體（作為對照）同時轉化大腸桿菌BL21（DE3），IPTG（終濃度為1mmol／L）誘導表達4h后收集菌體，菌體蛋白用SDS－PAGE膠進行電泳。操作方法按《分子克隆實驗指南》［1］進行。

1．2．5 重組蛋白的大量表達及電洗脫純化 按《分子克隆實驗指南》進行［1］。

1．2．6 間接免疫熒光檢測（IFTA） 用登革病毒2型感染后的C6／36細胞制成抗原片，登革熱病人血清及作為對照的正常人血清用0．01mmol／L PBS進行倍比稀釋。具體操作步驟參見文獻［2］。抗體效價以可以看見免疫熒光的血清最高稀釋度表示。

1．2．7 間接ELISA法檢測IgG 用純化的重組抗原包被板條（100ng／孔），37℃作用2h后，PBST洗滌1次，每孔加入封閉液（5%BSA／PBS）200μL，37℃作用2h，棄去孔中液體，加入待檢血清（用樣本稀釋液1∶20稀釋）100μL，37℃作用30min，PBST洗滌5次，加入酶標二抗100μL，37℃作用30min后PBST洗滌5次，加入顯色液顯色10min，最后加入2mol／L H2SO4終止反應。450nm波長下檢測OD值。以正常對照組血清平均OD值加上2S作為cutoff值［3］。以IFTA為標準，評價重組蛋白檢測登革2型IgG抗體的敏感度和特異性，公式為：敏感性＝真陽性／（真陽性＋假陰性）×100%；特異性＝真陰性／（真陰性＋假陽性）×100%。用重組抗原和澳大利亞Panbio IgG捕獲法ELISA試劑盒同時對標本進行檢測，結果用χ2檢驗分析。

2 結 果

2．1 重組質粒的酶切鑒定結果 重組質粒經EcoRⅠ／XhoI雙酶切后電泳，插入片段的大小與預期的一致（1 206bp），結果見圖1。同時測序結果表明，插入片段的序列與原病毒株的序列相符，且讀碼框正確，表明重組載體構建成功。

2．2 重組質粒的初步表達 重組蛋白由于融合了表達載體上58個氨基酸，預期分子量為50．8kD。重組質粒pET30a－DEN2經IPTG誘導后，用12%SDS－PAGE電泳，與對照菌（pET30a轉化BL21）相比，在45～66kD之間有一條明顯的蛋白帶，與預期分子量相符，見圖2。

圖1 重組質粒的酶切鑒定1：100bp Ladder DNA marker；2～4：pET30a－DEN2經EcoRⅠ／XhoⅠ雙酶切；5：pET30a經EcoRⅠ／XhoⅠ雙酶切Fig．1 Identification of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion1：100bp Ladder DNA marker；2－4：pET30a－DEN2digested by EcoRⅠ／XhoⅠ；5：pET30adigested by EcoRⅠ／XhoⅠ

圖2 重組質粒pET30a－DEN2表達產物的SDS－PAGE分析1：分子量標準（從上至下：66．0、45．0、36．0、29．0、24．0、20．1、14．2kDa）；2：pET30a－DEN2表達產物；3：pET30a表達產物Fig．2 SDS－PAGE analysis of expression on recombinant plasmid pET30a－DEN21：Molecule weight marker（from top to bottom：66．0，45．0，36．0，29．0，24．0，20．1，14．2kDa，respectively）；2：pET30a－DEN2product；3：pET30acontrol

2．3 重組蛋白應用于檢測登革2型IgG抗體 以純化重組抗原100ng／孔包被板條，用間接ELISA法檢測46份登革2型感染者血清、31份正常人血清和8份日本腦炎IgG陽性的人血清。46份患者血清中檢出44份陽性，31份正常人血清中檢出1例陽性，8份日本腦炎IgG陽性血清結果全為陰性。以IFTA為參照標準，重組抗原檢測登革2型IgG抗體的敏感性為95．6%，特異性為96．8%。用重組抗原和澳大利亞Panbio IgG捕獲法ELISA試劑盒同時對77份登革2型可疑感染者血清進行檢測，結果見表1。χ2檢驗顯示兩種方法對登革2型IgG的檢出率差別無統計學意義（P＞0．05）。

表1 重組抗原與Panbio試劑盒對77份登革2型可疑感染者血清IgG檢測結果的比較Tab．1 Comparison of detecting DEN2IgG in 77sera by indirect ELISA with recombinant protein and Panbio Dengue IgG capture ELISA

3 討 論

登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，是登革熱的病原體。其基因組編碼3個結構蛋白（C、prM／M、E）和7個非結構蛋白（NS1－5）。其中E蛋白在病毒吸附宿主細胞，pH介導或抗體特異性膜融合促進病毒進入細胞、病毒組裝以及誘導保護性免疫和病毒中和抗體中起著重要的作用［4－6］。因此E蛋白成為組裝檢測試劑盒和亞單位候選疫苗的常用抗原。國內外學者分別運用不同的載體、不同的表達系統對全長E基因進行了表達。Kelly［7］等人應用桿狀病毒表達登革2型全長E蛋白，并證實其免疫原性。魏惠永［8］在畢赤酵母細胞中成功表達登革2型全長E蛋白，并保留其免疫反應性。但是全長的E蛋白大多數表達產量較低，不利于重組蛋白的純化及研究應用。

通過對E基因序列的分析表明，E蛋白C端100個氨基酸為疏水區，因此選擇基因片段進行重組蛋白表達應避開此區域。研究表明，去除C端疏水區可以提高E蛋白的表達量。Sugrue［9］分別用大腸桿菌和畢赤酵母細胞表達登革1型全長E蛋白，發現畢赤酵母表達的全長E蛋白易降解，但是去除C端疏水區后產量提高至100μg／L而且不會降解。Chiu［10］等用大腸桿菌表達登革2型去除C端疏水區的E蛋白，重組蛋白可以抑制2型病毒感染BHK細胞時空斑的形成。本文采用大腸桿菌表達登革2型N端80%的E蛋白，純化后應用于登革2型IgG抗體的檢測，其靈敏度為95．6%，特異性達到96．8%，與同是黃病毒科黃病毒屬的日本腦炎病毒之間無交叉反應。與Panbio試劑相比，本研究獲得的重組蛋白具有相似的敏感性和特異性。Panbio公司生產的登革檢測試劑盒是目前世界上公認敏感性和特異性較好的試劑盒，其采用的重組抗原為昆蟲細胞表達的N端80%的E蛋白［11］。由于本研究研制的重組抗原采用原核表達系統，大大降低了成本，具有潛在的應用前景，同時也為研究其它型別的抗原提供了依據。但是對于研制的2型重組抗原是否具有型別特異性，與其它型別的登革病毒抗體是否有交叉反應，有待于收集其它型別的血清進一步進行研究。

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