不同動物宿主小腸結腸炎耶爾森氏菌分離及結果分析

肖玉春，梁俊容，古文鵬，邱海燕，王樹坤，羅隆澤，王化彬，景懷琦，王 鑫

小腸結腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica，Y．e）是引起國際社會廣泛關注的一種新發食源性致病菌。是能在冷藏溫度下生長的少數幾種腸道致病菌之一。近來國內外多次報道相關的人群感染。甚至是暴發流行［1－2］。它除引起胃腸道癥狀外，還能引起呼吸系統、心血管系統、骨骼結締組織等疾患，甚至可引起敗血癥，造成死亡。小腸結腸炎耶爾森菌分布廣泛，血清型眾多，有6個生物型，目前研究認為我國僅有O∶3、O∶9兩個血清型具有致病性［1－3］，生物型以2型、3型為主［4］，而非致病菌株以生物1A型為主。致病性菌株毒力基因分布特征為：ystA＋ail＋virF＋yadA＋ystB－或ail＋ystA＋virF－yadA－ystB－，而非致病性菌株毒力基因分布特征為：ystA－ail－virF－yadA－ystB＋ 或ail－ystA－virF－yadA－ystB－［5］。

為研究我國不同地區小腸結腸炎耶爾森菌的分布狀況及血清型、生物型和毒力基因的特征，對我國2010年云南、四川、黑龍江、內蒙4個地區部分宿主動物進行標本采集，冷增菌后進行小腸結腸炎耶爾森氏菌分離培養、并對分離到的小腸結腸炎耶爾森氏菌菌株進行血清分型、生物分型、毒力基因檢測。

1 材料和方法

1．1 標本、菌株來源 本科室承擔國家科技部重大專項和衛生部全國小腸結腸炎耶爾森菌病原學監測工作，因此我們對一些省份進行小腸結腸炎耶爾森氏菌病原學監測。本實驗3 649份標本均來自我國云南、四川、黑龍江、內蒙古省區。

參考菌株：國際參考菌株52203（O∶3血清型）、52211（O∶8血清型）、52212（O∶9血清型）、52206（O∶5）血清購自中國藥品生物制品檢定所。

1．2 主要試劑及儀器 耶爾森增菌緩沖液PBS、改良克氏雙糖瓊脂、半固體瓊脂均購自北京陸橋生物科技有限公司。尿素培養基購自日本榮研化學株式會社。耶爾森麥康凱選擇性培基由美國BD公司生產，API－20E試條為法國梅里埃生物公司生產，分型血清O∶3、O∶8、O∶9單克隆抗體由本研究室研究，O∶5血清型分型血清購自日本生研株式會社，生物分型試劑購自丹麥ROSCO公司，聚合酶鏈反應PCR所有試劑均購自上海生物工程有限公司。PCR儀由德國SENSO公司生產，型號為LabCycler standard plus，讀膠儀為BIORAD公司的Gel Documentation 2000。

1．3 菌株分離 將在4℃放置20d的標本增菌緩沖液搖均，取少量平行接種于耶爾森選擇性培基平板，培養兩天后，挑可疑菌落接種于改良克氏雙糖瓊脂培基，取雙糖陽性、不產硫化氫、不產氣或少量產氣菌株接種于尿素培基，尿素陽性菌株分別接種于2管半固體培基于25℃、37℃各培養48h，25℃動力陽性、37℃動力陰性菌株進行Api20E生化鑒定。

1．4 血清凝集試驗 將分離菌株的純培養物用生理鹽水制成濃厚菌懸液做血清玻片凝集試驗，同時生理鹽水做自然凝集對照試驗。

1．5 生物分型 小腸結腸炎耶爾森氏菌根據以下生化反應被分為生物1A、1B、2、3、4、5共6個生物型［6］見表1。

脂酶代謝反應鑒定：將待鑒定菌株接種于含有1%吐溫80、0．01%氯化鈣（CaCl2·H2O）的腦心浸液平板（或胰蛋白胨大豆肉湯平板），35℃培養4d，菌落周圍形成白色渾濁結晶物為陽性。

七葉苷代謝反應鑒定：將待測菌株點種于膽鹽－七葉苷平板（oxiod），置于25℃培養24h。生物1A型菌株分解七葉苷，使接種點周邊培養基變黑色；而其他生物型菌株則不變色。

其他生化指標鑒定使用生化反應藥片（丹麥Rosco公司）。按照分型藥片使用說明進行生化鑒定：刮取新鮮培養物置入裝有生理鹽水比濁管中，經麥氏比濁制成OD值為3．3～3．5菌懸液（吡嗪酰胺酶需用三蒸水制備菌懸液），分裝到1．5mL eppendorf管，每管250μL，放入需鑒定的生化指標藥片，25℃過夜培養，觀察顏色變化判讀結果。

表1 小腸結腸炎耶爾森菌生物分型Tab．1 Biotyping tor Yersinia enterocolitica

1．6 毒力基因鑒定 用文獻報道方法進行毒力基因檢測以確定菌株的致病性，檢測的基因為小腸結腸炎耶爾森菌毒力基因特異性引物：粘附侵襲位點基因（ail）、小腸結腸炎耶爾森菌耐熱性腸毒素基因（ystA）、小腸結腸炎耶爾森菌生物1A型攜帶的腸毒素基因（ystB）、粘附素（yadA，涉及到自凝、血清抗性和粘附）、yop調節子的轉錄活化作用（virF）［3，7－9］，引物及擴增條件見表2。

表2 實驗中所用引物Tab．2 The primers used in our study

2 結 果

2．1 標本分離菌株結果 將2010年來自云南、四川、黑龍江、內蒙古省區的3 386份家禽家畜、鼠類、旱獺等各類宿主標本進行小腸結腸炎耶爾森氏菌分離，結果分離出出134株小腸結炎耶爾森氏菌，分離率為3．96%。鼠、豬和旱獺的分離率分別為3．41%（78／266）、6．28%（53／844）和4．05%（3／74），分別占比例為58．21%、39．55%和2．24%．而檢查24頭牛、72頭羊、5只雞、3頭驢、2只鵝和個1只鴨、兔均陰性。

2．2 菌株血清型，生物型結果 對分離得到的134株小腸結腸炎耶爾森氏菌進行血清分型和生物分型，結果有30株為O∶3血清型，生物型全部為3型；O∶8血清型菌株有14株，O∶5血清型5株，生物型全為1A型；未知血清型85株，其中84株為生物1A型，1株為生物2型。

2．3 菌株毒力基因檢測結果 我們對134株小腸結腸炎耶爾森菌的ystA、ail、virF、yadA、ystB五個基因進行PCR檢測，結果顯示30株O∶3血清型菌株均攜帶ystA、ail、virF、yadA基因，而另外104株菌除了3株毒力基因全部陰性外，其它101株均攜帶ystB基因。這與我國小腸結腸炎耶爾森氏菌致病性菌株與非致病性菌株的血清型、毒力基因分布狀況一致。我國四省134株不同血清、生物型菌株的毒力基因分布狀況見表3。

表3 142小腸結腸炎耶爾森菌的毒力基因分布狀況Tab．3 The virulence gene of Yersinia enterocolitica

3 討 論

此次調查從3 386份各類宿主標本中分出134株小腸結炎耶爾森氏菌，總分離率為3．96%。各類宿主小腸結腸炎耶爾森氏菌分離率高低依次為豬（6．28%）、旱獺（4．05%）、鼠類（3．41%），顯示豬為小腸結腸炎耶爾森菌的主要宿主，這與國內外研究報道一致［10］。所以應加強對豬帶菌情況的監測工作，防止進食污染的豬肉及其制品而感染小腸結腸炎耶爾森氏菌。在牛、羊、雞、驢、鵝、鴨、兔糞便標本中均未檢出小腸結腸炎耶爾森菌，這可能與此次檢測的標本數量不夠多有關。但以往大量的調查表明牛、鳥、魚、狗、貓、羊、兔等家禽家畜可攜帶該菌［8］，應引起重視。分離到的134株菌中致病性菌株有30株（22．39%），全部為O∶3血清型，生物3型且均來自豬中。進一步證實豬為人類感染小腸結腸炎耶爾森氏菌的主要來源。歐美等國O∶3血清型菌株主要是生物4型。非致病菌株以生物1A型為主占99．04%。由于我國分型血清不完全，還有85株未知血清型菌株。致病性小腸結腸炎耶爾森菌（ystA＋ail＋virF＋yadA＋ystB－）30株（22．39%），PCR結果顯示全部攜帶毒力質粒。非致病性菌株104 株，其 中 （ystA－ail－virF－yadA－ystB＋ ）101 株（75．37%），另外有（ystA－ail－virF－yadA－ystB－）3株（2．24%）。

［1］Cover TL，Aber RC．Yersinia enterocolitica［J］．NEnglJMed，1989，321：16－24．

［2］Bottone EJ．Yersinia enterocolitica：the charisma continues［J］．Clin．Microbiol．Rev，1997，10：257－276．

［3］Thoerner P，Bin Kingombe CI，Bogli－Stuber K，et al．PCR detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis and investigation of virulence gene distribution［J］．Appl．Environ．Microbiol，2003，69：1810－1816．

［4］肖玉春，王鑫，邱海燕，等．中國致病性小腸結腸炎耶爾森菌生物分型研究［J］．中國人獸共患病學報，2010，26（7）：651－653．

［5］景懷琦，李繼耀，肖玉春等．O：3和O：9小腸結腸炎耶爾森菌主要毒力基因分布調查［J］．中國媒介生物學及控制雜志．2004，15（4）：317－319．

［6］景懷琦．小腸結腸炎耶爾森菌［M］．北京：人民衛生出版社．

［7］Weynants V，Jadot V，Denoel PA，et al．Detection of Yersinia enterocolitica o：3by a PCR Method［J］．Journal of Clinical Microbiology，1996，34：1224．

［8］Wang X，Z Cui，D Jin，et al．Distribution of pathogenic Yersinia enterocolitica in China［J］．Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2009，28：1237－1244．

［9］Wang X．，H Qiu，D Jin，et al．O：8serotype Yersinia enterocolitica strains in China［J］．Int J Food Microbiol，2008，125：259－266．

［10］Fredriksson－Ahomaa，Stolle M A，Stephan R．Prevalence of pathogenic Yersinia enterocoliticain pigs slaughtered at a Swiss abattoir［J］．Int J Food Microbiol，2007，119：207－212．