致鵝敗血癥糞腸球菌溶血素激活因子基因克隆及序列分析＊

狄婷婷，高 原，聶 鑫

腸球菌引起醫院內病人感染和死亡的例數正在逐步 增 加［1］，其 致 病 菌 主 要 是 糞 腸 球 菌［2－3］。 近 年來，動物感染腸球菌發病和死亡的報道也越來越多［4］，糞腸球菌也是其主要致病菌［5－7］。腸球菌中的屎腸球菌可以通過發病豬直接傳染人，引起人發病死亡［5］，是新發現的人畜共患病病原體。Larsen J等在臨床患傳染性心內膜炎的老年病人體內分離到豬源糞腸球菌，有的病人因此而死亡，證明糞腸球菌也是一種新的人畜共患病病原菌［8］。研究發現，豬源糞腸球菌毒力島基因與人源相關基因、致羔羊腦炎糞腸球菌毒力因子基因片段與醫學臨床中某些該菌的相關基因片段同源性很高，因此認為人與動物糞腸球菌之間存在基因水平轉移或存在著某種聯系［9－10］。此外，糞 腸 球 菌 也 能 引 起 人 食 物 中 毒［11］。劉磊從新鮮豬肉中分離到11株糞腸球菌，致病基因檢出率非常高，提示動物性食品中的糞腸球菌具有一定致病力［12］，存在著經肉食品感染人的危險。在歐洲，將糞腸球菌作為益生菌飼料添加劑來調節腸道菌群，同時用與萬古霉素交叉耐藥的阿伏霉素作促生長劑，結果在動物腸道內誘導耐萬古霉素腸球菌大量增殖，會通過食品傳播給人類。除耐萬古霉素腸球菌外，耐慶大霉素腸球菌也可通過食品由動物傳播給人［13］。腸球菌的多重耐藥性也能通過質粒在人和飼養動物之間有效傳播［13－14］。因此，致病性糞腸球菌研究具有重要的公共衛生學意義。

糞腸球菌感染致死主要由其毒力因子所致，毒力因子包括細胞溶解素（Cyl）、膠原蛋白黏附素（Ace）、表面蛋白（esp）、聚集物質（As）、明膠酶 E（gelE）、心內膜炎抗原（efaA）、信息素（pheromone）等［15］。其中Cyl是主要毒力因子，它能增強細菌的感染和致死能力。Cyl由結構基因CylL1和CylLs、修飾基因CylM、轉運基因CylB、激活基因CylA和免疫基因CylI組成［16］。其中CylA能激活Cyl前體蛋白，是Cyl獲得溶解細胞活性從而具有感染致死能力的關鍵因素，也是致病性研究的主要毒力因子［17］。

將臨床分離的4株致鵝敗血癥糞腸球菌的CylA基因片段克隆到pMD18－T載體中，進行序列測定，與GenBank登錄的國外從人體分離的和國內從豬體分離的致病性糞腸球菌CylA基因序列做同源性比對分析，了解糞腸球菌的CylA基因的遺傳變異情況，為遴選致病性糞腸球菌檢測診斷、免疫預防的靶基因和研究溶血素激活基因功能奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 菌株 本試驗使用的致鵝敗血癥糞腸球菌ME1、ME2、ME3和 ME4，由本實驗室通過形態學和生長耐受性觀察，菌屬區別、分群和菌種鑒定試驗，16SrDNA檢測、系統進化分析和致病性試驗鑒定為糞腸球菌并根據它們相同的16SrDNA序列統一命名為TLME3，提交GenBank，登陸序列編號為：HQ831431［18］。參考菌株 ATCC29212為標準菌株質控糞腸球菌，購自南京便診生物科技有限公司；大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。

1．2 主要試劑 Taq酶購自Promega公司；dNTPs、DNA Marker（DL2000和 DL15000）、限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、克隆載體pMD18－T、蛋白酶K、T4DNA連接酶，購自Takara公司；Tris－平衡酚、溶菌酶、Solarbio凝膠回收試劑盒、Tris堿、EDTA、SDS、EB購自上海Solarbio生物科技公司；北京莊盟質粒小量抽提試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。其它試劑為國產分析純。

1．3 引物 引物序列根據NCBI數據庫中Gen－Bank上注冊號為AF329367的糞腸球菌致病島全序列（Enterococcus faecalis putative pathogenicity island，partial sequence；and IS905－like sequence，complete sequence）2 699～3 937bp處的CylA基因序列，通過 Primer Primier5．6．0和 Oligo 6．71 Demo引物設計軟件，設計擴增引物兩對（F1、R1和F2、R2）。并分別在擴增引物的上、下游5＇端加入序列為EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點（用斜體加下劃線表示）。引物由大連寶生物有限公司合成。

引物序列為：

1．4 方法

1．4．1 CylA基因的PCR擴增 按照參考文獻19記載的方法分別提取4株致鵝敗血癥糞腸球菌總DNA［19］。參照表1、表2的反應體系和反應條件進行PCR擴增。

表1 CylA基因的PCR反應體系Tab．1 PCR reaction system of CylA gene

表2 CylA基因的PCR反應條件Tab．2 PCR reaction condition of CylA gene

1．4．2 PCR產物的克隆和篩選 用0．8%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物做分離和檢測分析。分離后，切下含目的DNA片段的條帶，按Solarbio凝膠回收試劑盒操作說明對其進行回收。參照大連寶生物有限公司pMD18－T載體說明書，將PCR產物（目的片段CylA）與pMD18－T載體連接，轉化進入大腸桿菌DH5α中，挑取白色陽性菌落進行EcoRI、XhoI雙酶切鑒定（反應體系見表3）。加入上述成分后，瞬間離心混勻，37℃反應1．5h，用0．8%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1．4．3 核苷酸序列測定和分析 將鑒定正確的重組質粒送大連寶生物有限公司進行測序，以雙向堿基互補的測定結果為準。用Lasergene 7．0軟件中的EditSeq尋找閱讀框，用MegAlign程序中的Jotun Hein方法，對測定的CylA基因序列與Gen－Bank登陸的國外從人體分離的和國內從豬體分離的各4株致病性糞腸球菌CylA基因［12］，進行核苷酸序列及推導的氨基酸序列同源性比對（參比序列見表4），并構建系統進化發育樹。

表3 pMD18－T－CylA雙酶切反應體系Tab．3 Reaction system of double enzyme digestion for pMD18－T－CylA

表4 參與比對的序列Tab．4 The sequence for alignment

2 結 果

2．1 溶血素CylA基因PCR擴增和重組質粒雙酶切鑒定結果 用引物F1、R1、F2、R2擴增的4株致鵝敗血癥糞腸球菌CylA基因片段，經0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，4個條帶均長約1 239bp，與預期和參考菌株ATCC29212CylA基因相符，蒸餾水陰性對照沒有特異性條帶（圖1）。

重組質粒pMD18－T－CylA EcoRI、XhoI雙酶切鑒定結果顯示，重組質粒中含有1 239bp的PCR產物的目的外源片段，2 692bp的條帶為質粒載體（圖2）。

2．2 CylA基因序列測定結果及分析 重組質粒測序結果表明，4株致鵝敗血癥糞腸球菌CylA基因序列均長1 239bp，用EditSeq尋找結果顯示，均為一完整的開放閱讀框，編碼412個氨基酸。

圖1 CylA基因PCR擴增結果M：Marker DL2000；M1：參考菌株ATCC29212陽性對照；M2：ME1擴增產物；M3：ME2 擴增產物；M4：ME3擴增產物；M5：ME4擴增產物；M6：蒸餾水陰性對照；M7：大腸桿菌陰性對照Fig．1 Result of PCR for CylA geneM：DL2000DNA Marker；M1：Positive control of reference strains ATCC29212；M2：Product of ME1；M3：Product of ME2；M4：Product of ME3；M5：Product of ME4；M6：Negative control of distilled water；M7：Negative control of Escherichia Coli

2．2．1 CylA基因序列和推導的氨基酸序列的變異

表5為鵝源、人源和豬源致病性糞腸球菌CylA基因相關序列及推導的氨基酸序列，用MegAlign中Jotun Hein方法進行比對的結果。比對結果顯示，ME1－ME4CylA基因序列無缺失和插入，僅666 bp堿基由T突變為C，這一突變發生在密碼子第3個核苷酸上，是無義突變，未引起其編碼的222位氨基酸變異。與其相同的是豬源的HE9，核苷酸、推導的氨基酸均未變異。變異程度相近的有豬源的HE12、HE1，人 源 的 AF329367、AF454824、AY032999以及L37110。而豬源的HE30變異程度稍大（表5）。

圖2 重組質粒pMD18－T－CylA雙酶切鑒定凝膠電泳結果M：Markerλ－EcoT14Ⅰdigest；M1：ME1酶切產物；M2：ME2酶切產物；M3：ME3酶切產物；M4：ME4酶切產物；M5：蒸餾水陰性對照Fig．2 Result of detection with double enzyme digestion for recombinant plasmid pMD18－T－CylAM：Markerλ－EcoT14Ⅰdigest；M1：Product of ME1；M2：Product of ME2；M3：Product of ME3；M4：Product of ME4；M5：Negative control of distilled water

表5 CylA核苷酸及推導的氨基酸變異比較Tab．5 Comparison on variation of nucleotide and deduced amino acid for CylA

2．2．2 CylA基因推導的氨基酸序列同源性分析用Lasergene 7．0軟件中MegAlign繪制的鵝源、人源和豬源致病性糞腸球菌CylA基因推導的氨基酸序列系統進化發育樹見圖3，同源性分析結果見圖4。

應用 Lasergene 7．0－MegAlign中Jotun Hein方法構建的推導的氨基酸序列系統進化發育樹顯示，參與比對的12株細菌的CylA基因推導的氨基酸序列來源于共同的祖先。ME1－ME4及HE9支長相等，同源性為100%；ME1－ME4與 HE1、HE12的遺傳距離最近，處于同一小分支，同源性為99．8%；與 AF454824、AY032999、AF329367的遺傳距離很近，處于同一個節點的不同小分支，同源性為99．5%；與L37110和HE30的遺傳距離也很近，雖然處于不同分支，但同源性也較高，分別是99．5%和98．6%。

3 討 論

3．1 本試驗使用的致病菌，是由本實驗室通過分離純化和形態學觀察、菌屬區別和分群試驗，經過亞碲酸鹽和丙酮酸鹽利用試驗、依羅霉素敏感試驗、甲基葡萄糖吡喃糖苷產酸試驗和色素產生試驗等鑒定糞腸球菌的關鍵性試驗，最后采用16SrDNA測定這一目前種間關系相近的細菌菌種鑒定和分類的標準方法［20］，鑒定為糞腸球菌的菌株。該菌株分離自表現實質臟器腫大、淤血、出血、壞死和滲出纖維素等敗血癥變化的雛鵝，并且在試驗中該菌株具有β－溶血和使實驗動物發生敗血癥的特性，表明該糞腸球菌菌株是雛鵝敗血癥的病原。目前國內未見糞腸球菌致鵝敗血癥的報道，因此，分離菌株是雛鵝敗血癥一個新病原。由于人和動物感染糞腸球菌發病和死亡的報道越來越多，該分離菌株有可能是新的人畜共患病病原體。

3．2 Cyl是糞腸球菌的主要致病物質，它能溶解動物細胞，加重感染程度，提高細菌致死能力；其毒性及致死能力遠高于其它毒力因子。Cyl表達后經修飾生成無活性的結構蛋白中間產物，必須經CylA激活才具有溶細胞活性。因此CylA的激活作用是糞腸球菌致病性的標志。本試驗成功克隆了4株致鵝敗血癥糞腸球菌溶血素CylA基因，證明分離的糞腸球菌具有致病性；同時，為在原核細胞中表達該基因和進行其功能研究奠定了基礎。

3．3 試驗結果顯示，參比的鵝源、人源、豬源致病性糞腸球菌CylA基因具有如下特點：序列無缺失和插入；ME1～ME4僅有一處核苷酸發生無義突變但未引起氨基酸變異；其余參比序列的變異率也很低，為0%～0．48%，個別為1．45%；系統進化發育樹上遺傳距離很近；人源菌、豬源菌與鵝源菌相比，具有高達98．6%～100%的同源性。這些特點證明了Phillp S．Coburn等關于糞腸球菌CylA基因高度保守的論述［21］，提示CylA有可能成為多種動物糞腸球菌性疾病的診斷及保護性抗原的候選基因。

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