布魯氏菌S2株菌殼的制備研究＊

劉 爽，劉 軍，2，何永聚，祝令偉，2，孫 洋，2，周 博，2，紀 雪，2，馮書章，2

布魯氏菌（Brucellaspp．）是一種重要的胞內寄生性人獸共患病原菌。它的流行范圍廣，傳染性強。布魯氏菌抵抗力較強，在土壤、毛皮、病畜的臟器及其分泌物中可生存數周至數月，人及家畜均易感［1］。布魯氏菌可引起人、家畜及其他動物的布魯氏菌病。布病是一種家畜和野生動物均能感染的傳染病，主要癥狀為發熱、流產、不育、慢性關節炎及神經損害等，主要能引起懷孕的雌性動物在懷孕后期流產，以及雄性動物的睪丸炎和附睪炎。布魯氏菌病嚴重危害人類健康和畜牧業發展，導致世界范圍內的嚴重經濟損失和公共衛生問題［2］。

近年來，菌殼（Bacterial ghosts）正作為一種新型候選疫苗，應用于許多種革蘭氏陰性細菌的研究中［3］。它是在導入細菌細胞內的噬菌體PhiX174裂解基因E表達后，在細菌表面形成跨膜孔道，通過跨膜孔道，內容物如核酸、核糖體等即可流出細胞，從而形成細菌空殼［4］。這種方法是以非變性方法來滅活細菌，使菌體保持了原始細胞的表面抗原結構，外膜的這些天然結構使菌殼自身具有內在的佐劑活性［5］，對增強由外膜抗原引起的免疫應答起重要的作用。此外，可以利用細菌在外膜表達外源抗原，再經蛋白E裂解成菌殼，免疫后菌殼能將內源性和外源性抗原同時遞呈給免疫系統，因此可將菌殼制備成為疫苗遞送載體［6］，以此來加強機體免疫反應。

布魯氏菌S2株是一種弱毒疫苗，對豬、牛和羊均能產生較好的免疫，在我國被廣泛使用。但由于其屬于弱毒活菌疫苗，仍然具有一定的毒力，且存在著返祖的可能性。為了開發安全性更高、保護效力更好的布魯氏菌疫苗，本研究將pBV220∶∶E質粒中的溫度敏感啟動阻遏系統和裂解基因E融合片段λpL／pR－cI857－E 克隆至載體 pBBR1MCS－2上，通過改變溫度，控制裂解基因E在重組菌S2（pBBR1MCS－E）中的表達，制備了布魯氏菌S2菌殼，為布魯氏菌菌殼疫苗的開發奠定了基礎。

1 材料和方法

1．1 材料 重組質粒pBV220：：E由本實驗室構建［7］；pBBR1MCS－2由路易斯安那州立大學醫學中心Kovach教授惠贈［8］；布魯氏菌S2株由本室保存；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen生物技術有限公司；T4DNA連接酶、DL2000DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司。

1．2 溫控調節盒和裂解基因E的PCR擴增 根據pBV220∶∶E上溫控調節盒λpL／pR－cI857和裂解基因E的編碼序列設計兩條引物BRU1：5′－cc act agt att acc gcc ttt gag tga－3′和 BRU2：5′－cc gtc gac tca ggagag cgt tca cc－3′，上下游引物5′端分別引入限制性酶切位點SpeI和SalI。以重組質粒pBV220∶∶E為模板，按照以下條件進行PCR擴增：94℃預變性2min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸3min，30個循環后，72℃延伸10 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。回收純化PCR產物，即溫控調節盒和裂解基因E的融合片段PL／PR－E。

1．3 溫控調節重組質粒pBBR1MCS－E的構建將pBBR1MCS－2質粒進行SpeI和SalI雙酶切，將酶切后的質粒片段純化回收，用T4DNA連接酶將其與PL／PR－E片段于4℃過夜連接。再將連接產物電轉化（2 500kV，5ms）至大腸桿菌DH5α，轉化后菌液涂布于含有卡那霉素（100μg／mL）的腦心培養基平板，28℃過夜培養。挑取單菌落接種于5 mL LB培養液（Kan 100μg／mL），28℃培養后提取質粒，用限制性內切酶SpeI和SalI進行雙酶切鑒定，鑒定正確的重組質粒即為熱敏裂解質粒pBBR1MCS－E。

1．4 重組布魯氏菌S2（pBBR1MCS－E）的構建與菌殼的制備 將熱敏裂解質粒pBBR1MCS－E電轉化至布魯氏菌S2菌株，涂布于腦心培養基（Kan 100 μg／mL）平板，挑取單菌落于5mL腦心培養液（Kan 100μg／mL），28℃振蕩培養過夜，通過PCR擴增E基因鑒定重組菌株。將鑒定正確的重組菌株S2（pBBR1MCS－E）接種于腦心培養液，28℃搖床培養至OD600值約為1．5，迅速升溫至42℃誘導培養2d后離心收集沉淀，再以生理鹽水洗滌即得菌殼。

1．5 重組布魯氏菌S2（pBBR1MCS－E）溶菌動力學實驗 將布魯氏菌S2（pBBR1MCS－E）接種于腦心培養液（Kan 100μg／mL），次日將細菌轉接入2瓶腦心培養液（Kan 100μg／mL）中，28℃振蕩培養至OD600約為1．5。其中一瓶于28℃繼續培養，另一瓶轉移至42℃誘導培養。另接種布魯氏菌S2于腦心培養液中，在28℃振蕩培養作為對照。間隔6 h監測OD600值，繪制布魯氏菌S2生長曲線和菌殼的裂解曲線。

1．6 溶菌質粒pBBR1MCS－E對布魯氏菌S2的裂解率測定實驗 將誘導前和誘導結束后的菌液分別以適當倍數稀釋，涂于腦心培養基（Kan 100μg／mL）平板，28℃恒溫箱培養2d，計算活菌數（cfu／mL），重復3次取平均值。計算出重組質粒pBBR1MCS－E對布魯氏菌S2的裂解率。裂解率＝（1－誘導后cfu／誘導前cfu）×100%。

1．7 布魯氏菌S2菌殼形態學觀察 將28℃培養的布魯氏菌和42℃誘導培養制備的S2菌殼離心，用生理鹽水洗滌3次并重懸，染色固定后用透射電鏡進行觀察。

2 結 果

2．1 溫控調節盒λpL／pR－cI857和裂解基因 E 融合片段的PCR擴增 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳見圖1所示，結果擴增出了與預期大小一致的片段。

2．2 熱敏溶菌質粒pBBR1MCS－E的鑒定 將溫控調節盒和裂解基因E融合片段克隆到質粒pBBR1MCS－2中，再進行雙酶切鑒定。酶切產物電泳結果如圖2所示，說明熱敏裂解質粒pBBR1MCS－E構建正確。

2．3 重組布魯氏菌S2（pBBR1MCS－E）的鑒定 將熱敏溶菌質粒pBBR1MCS－E電轉化到布魯氏菌S2后，PCR鑒定重組菌結果如圖3所示，與預期結果一致，說明溫敏裂解質粒pBBR1MCS－E已經成功轉化至布魯氏菌S2中。

2．4 重組布魯氏菌S2（pBBR1MCS－E）溶解動力學實驗 布魯氏菌S2和重組菌株S2（pBBR1MCSE）的生長曲線和裂解曲線見圖4所示。結果顯示熱敏溶菌質粒pBBR1MCS－E對布魯氏菌S2有很高的裂解效率。42℃條件下誘導約6h后OD600達到峰值，之后逐漸下降。而28℃培養條件下的重組菌S2（pBBR1MCS－E）與布魯氏菌S2生長曲線一致。

圖4 布魯氏菌S2和重組菌S2（pBBR1MCS－E）的生長曲線和裂解曲線Fig．4 Growth and lysis curves of Brucella S2and recombinant S2（pBBR1MCS－E）The arrow indicates bacterial cultures were shifted from 28℃to 42℃．

2．5 溶菌質粒pBBR1MCS－E對布魯氏菌的裂解效率 根據誘導前和誘導結束后的菌液計算活菌數（cfu／mL），重組質粒pBBR1MCS－E對布魯氏菌S2的裂解率為（1－3．65×105／5．85×109）×100% ＝99．99%。

2．6 電鏡觀察布魯氏菌S2菌殼形態 電鏡觀察結果如圖5所示，布魯氏菌菌殼保持著細菌的基本細胞形態，但由于細胞內容物外流而使細胞變形，細胞表面發生明顯皺縮。

圖5 電鏡觀察布魯氏菌S2和菌殼的形態Fig．5 Morphology observation of BrucellaS2（A and B）and Brucellaghosts（C and D）under the electron microscope

3 討 論

控制和預防布魯氏菌病的最好方法就是使用疫苗，迄今國內外已有多個布魯氏菌疫苗在使用，如獸用減毒活疫苗有S19、104M、S2、M5、牛種布魯氏菌45／20、羊種布魯氏菌 H38等，人用活疫苗主要有19－B和104M等。雖然這些疫苗都具有一定保護效力，但均有副作用大的缺點。

菌殼這一新型的細菌性疫苗，正廣泛的應用于預防細菌性傳染病的研究。菌殼具有原始的細胞形態和天然表面抗原，其失活過程不會引起細菌表面結構任何的物理變性和化學變性。菌殼內在的佐劑活性能增強針對外膜抗原的免疫應答，包括對T細胞的激活作用和粘膜免疫［9］。通過基因工程方法對細菌表面成分進行改造后，菌殼的作用還可大為拓展，是很好的多聯疫苗預備株。雖然目前還沒有菌殼疫苗被用于臨床，但已有多種細菌被制備成了菌殼，包括出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic E．coli）［10］、致病性大腸桿菌（Enteropathogenic E ．coli）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）［11］、Edwardsiella tarda［12］、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）［13］等，這 些 研究均表明細菌菌殼具有良好的安全性和免疫保護作用，可作為預防細菌性傳染病的候選疫苗。為了研究利用布魯氏菌菌殼作為疫苗來預防布病的可行性，本研究利用噬菌體裂解蛋白E制備了布魯氏菌菌殼。

為了制備布魯氏菌菌殼，本研究使用了pBBR1MCS－2質粒。該質粒的宿主范圍廣，已經被證實可以在多種細菌中復制，如百日咳桿菌（Bordetellaspp．）、布魯氏菌（Brucellaspp．）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、惡臭假單胞菌（P．putida）、球 形 紅 假 單 胞 菌 （Rhodobacter sphaeroides）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）等。通過對該質粒進行改造，加入了溫控表達調節系統λpL／pR－cI857和裂解基因E，成功構建了重組質粒pBBR1MCS－E，并利用該重組質粒制備了布魯氏菌菌殼，裂解完成的菌殼再通過高滲溶液中凍融，即可完全清除其中殘存的活菌，達到100%滅活的效果。本研究成功制備了布魯氏菌這一胞內病原菌的菌殼，為下一步進行該菌殼作為疫苗的可行性研究奠定了基礎，也為研制胞內病原菌疫苗提供了新的思路和技術路線。

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