流感病毒感染p53＋／＋和p53－／－小鼠肺組織中TLR及其相關基因表達研究＊

晏文君，史子學，魏建超，鄧緒芳，朱紫祥，邵東華，王少輝，李蓓蓓，馬志永

甲型流感病毒（Influenza A Virus，IAV）屬于正黏病毒科，單股負鏈分節段的RNA病毒，是近年來對人類健康及養殖業造成嚴重危害的呼吸道疾病病原。根據病毒粒子表面血凝素（hemagglutinin，HA）和神經氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性不同，分別分為16個亞型（H1－H16）和9個亞型（N1－N9），它們之間的變異及重組造成了流感病毒的高變異性，給流感病毒防治帶來了嚴重的困難［1－2］。

近年來關于IFN－β抗流感病毒機制的解釋［3］以及一些新的抗流感病毒分子RIG－Ⅰ、GBP1和p53等的發現為闡明機體抗流感病毒免疫反應機制提供了新的思路［4－6］。其中腫瘤抑制因子p53作為機體基因的守護者，其抗病毒機制是近來關注的重點。研究表明，干擾素調節基因5（interferon regulatory factor 5gene，IRF－5）、IRF9是 p53的靶基因［7－8］，IFN－Ⅰ上調 p53的表達［9］，p53具有抑制炎癥作用［10］。Toll－like receptor（TLR）在先天性免疫以及后續的獲得性免疫反應中發揮重要的作用，最近證實TLR3是p53的靶基因［11］以及p53具有調控TLR信號通路的作用［12］。據報道，TLR3在啟動流感病毒免疫應答中發揮重要作用［13］，p53基因敲出小鼠抗流感病毒的先天性和獲得性免疫應答受到影響［6］，我們同樣發現p53基因敲出小鼠的抗流感能力顯著下降。那么，在流感病毒感染過程中，p53與TLR信號通路間是否存在相互作用，p53功能喪失是否影響TLR信號通路功能是值得研究的科學問題，其結果將有助于闡述和解釋p53抗流感病毒的作用機制 。

為了探討在流感病毒感染過程中，p53對TLR信號通路的調控作用，本研究通過流感病毒PR8感染p53基因野生型（p53＋／＋）和p53基因敲出（p53－／－）小鼠，通過基因芯片技術分析了兩種小鼠肺臟組織中TLR信號通路相關基因的表達變化，為闡述和解釋p53抗流感病毒的作用機制提供了基礎數據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 8～10周齡，p53＋／＋和p53－／－C57BL／6小鼠由本實驗室（中國農業科學院上海獸醫研究所公共衛生實驗室）飼養、繁殖并對小鼠p53基因型進行檢測。

1．1．2 毒株 實驗采用流感病毒PR8株（A／Puerto Rico／8／34（H1N1）），由中國農業科學院上海獸醫研究所童光志研究員惠贈。

1．1．3 主要試劑 乙醇、酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1V／V）、SNET BUFFER（20mmol／L Tris－Cl，pH 8．0；5mmol／L EDTA，pH 8．0；400mmol／L NaCl；1%SDS，m／V）、蛋白酶 K（20mg／mL）、dNTP、rTaq酶。

1．2 方法

1．2．1 小鼠基因組DNA提取 參照分子克隆實驗手冊，剪取10～20d齡小鼠鼠尾末端三分之一放入1．5mL Eppendorf管中，加入400μL裂解緩沖液（蛋白酶K濃度為400μg／mL的SNET Buffer），水浴鍋中55℃過夜。加入等體積的酚：氯仿：異戊醇，室溫劇烈振蕩3～5min。12 000r／min離心10 min。取上清于另一新Eppendorf管中，加入等體積異丙醇沉淀DNA。1 200r／min離心10min，去除異丙醇，加入70%乙醇洗滌，除去70%乙醇，室溫涼干，200μL TE溶解。

1．2．2 小鼠p53基因型檢測 PCR擴增p53＋／＋、p53－／－基因，引物為：

根據TaKaRa rTaq操作說明PCR擴增條件為：95℃變性5min；95℃變性30s，57℃退火30 s，72℃延伸1min，5個循環；94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環；最后72℃，延伸10min。取PCR產物10μL，進行15g／L瓊脂糖凝膠電泳，最后利用凝膠成像系統觀察并拍照。

1．2．3 病毒滴度——雞胚半數感染劑量（50%egg infections dose，EID50）測定 參照流感病毒標準操作規程，將病毒儲存液用PBS溶液進行系列10倍稀釋，從10－1～10－14每枚雞胚接種0．1mL稀釋液，每個稀釋度接種3枚雞胚。35℃溫箱培養，72 h后收獲病毒尿囊液并進行紅細胞凝集（HA）滴定。根據Reed－Muench方法，計算病毒EID50。

1．2．4 病毒對小鼠半數致死量（50%lethal dose，LD50）測定 將8～10周齡p53＋／＋小鼠30只，平均分成6組，每組5只。病毒液用PBS進行系列10倍稀釋，每只小鼠從鼻內接種病毒稀釋液25μL，觀察小鼠死亡情況，并記錄，最后根據Reed－Muench方法，計算得到病毒對小鼠半數致死劑量LD50。

1．2．5 基因芯片分析小鼠肺臟基因表達情況p53＋／＋、p53－／－小鼠各12只，分別分成4組，每組3只，兩組鼻內接種1LD50的病毒液，另外兩組接種25μL PBS作為對照。在感染病毒后第3d，第6 d各處死1組小鼠并采取肺臟，凍存于液氮中。由上海伯豪生物技術有限公司采用Affymetrix Mouse 430 2．0基因芯片，分析小鼠肺臟RNA表達情況。其中，每組小鼠肺組織提取的總RNA即為一個樣品。

1．2．6 挑選出TLR通路基因數據進行整理分析登錄由上海伯豪生物技術有限公司生物服務在線所 提 供 的 SAS 系 統 （http：／／www．ebioservice．com／），并參照有關基因芯片分析方法進行差異基因及基因信號通路分析。

2 結 果

2．1 小鼠基因型檢測及分析 PCR方法檢測小鼠p53基因，p53＋／＋基因PCR產物大小約為400 bp，p53－／－基因PCR產物大小約為250bp（如圖1）。圖中3只小鼠基因型分別為p53＋／－、p53＋／＋、p53－／－。

圖1 小鼠p53基因結果示例Fig．1 Example of mice p53gene detection

2．2 EID50及LD50的測定 通過雞紅細胞凝集實驗對流感病毒PR8EID50測定。經計算，得到流感病毒對雞胚半數感染劑量為：EID50＝10－9．36／100 μL（表1）。通過流感病毒稀釋液鼻內接種p53＋／＋小鼠25μL測定病毒對小鼠的半數致死量。經計算，得到PR8對小鼠的半數致死量為：LD50＝10－3．34／50μL，實驗中接種小鼠劑量1LD50為4．1×105EID50的病毒（表2）。

表1 流感病毒PR8雞胚半數感染劑量測定結果Tab．1 Detection results of EID50for PR8

2．3 TLR基因表達水平檢測 通過real－time PCR對基因表達譜芯片結果的進行驗證，結果相符（real－time PCR結果省略）。篩選出 TLR基因，并對其表達結果進行分析。發現p53＋／＋與p53－／－小鼠相比，在流感病毒感染后，第3dTLR4表達下調，TLR8表達上調；第6dTLR1、TLR2、TLR6、TLR7、TLR8表達上調，TLR9表達下調（圖2）。

表2 PR8對小鼠的半數致死劑量Tab．2 Detection results of LD50for PR8

圖2 病毒感染3d和6d后，TLR基因表達結果Fig．2 Expressions of TLRs genes on day 3and day 6after the infection of PR8

2．4 TLR通路差異表達基因 對TLR信號通路基因表達水平分析，發現在病毒感染3d后，p53＋／＋與p53－／－小鼠相比有17個基因表達上調，19個基因表達下調；在病毒感染6d后，有16個基因表達上調，17個基因表達下調（圖3）。2．5 差異表達基因在TLR信號通路中的分析病毒感染后，第3dTLR信號通路中TLR8、Rac1、AKT、JNK、p38、IFN－α、AP－1、CD40、IRF7等基因表達 上 調；TLR4、CASP8、TNF－α、IL－1β、IL－12、CD80、CD86、NF－κB 等表達下調；TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR9、MyD88、IRF5、IFN－β、IL－8、IL－6等基因表達沒有明顯變化。與炎癥反應有關基因表達下調，而與免疫細胞激活及抗病毒反應有關的基因表達上調（圖4）。

2．6 病毒感染后第6d TLR1、TLR2、TLR6、TLR7／8、P13K、P38、IFR7、IL－12、IFN－α、IP－10 等基因表達上調；TLR9、CD80等基因表達下調；TLR3、TLR4、TLR5、JNK、IRF5、MyD88、NF－κB、IL－6、IL－1β、IFN－β等基因表達水平沒有發生變化。與第3d相比，趨化反應相關基因表達上調，而與免疫細胞激活相關的基因表達下調（圖5）。

3 討 論

腫瘤抑制因子p53作為基因組的守護者，通過細胞周期捕獲和促進細胞凋亡而阻止癌細胞及機體腫瘤的發生，還能參與DNA損傷修復、調節機體代謝及調節繁殖生育等功能。從發現p53與NF－κB有密切關系［14］，PKR、ISG15、TLR3、IRF5、IRF9等是其靶基因以來［15－16］，p53抗病毒作用就一直受到關注。2003年，Takaok A等在Nature上首次報道，p53具有抗水泡性口炎病毒的作用，開辟了p53抗病毒研究的里程碑［9］。隨后，分別有關于p53抗新城疫病毒、Ⅲ 型人副流感病毒、人腦心肌炎病毒、脊髓灰質炎病毒的報道。

圖5 流感病毒感染后第3d，TLR主要通路中基因表達變化情況Fig．5 Expression of TLR pathway genes on day 3after the infection of IAV

在流感病毒研究上，p53參與調控流感病毒感染細胞的凋亡，流感病毒感染后機體p53蛋白水平呈現雙向變化，流感病毒NS1具有抑制p53活性的報道［17－18］。2011 年，Munoz－Fontela C 等 報 道 p53參與調控流感病毒的先天性和獲得性免疫反應，具有抗流感病毒作用［6］。但是，關于p53抗流感病毒的具體機制尚不清楚，有待于進一步研究。本研究通過流感病毒PR8毒株感染p53＋／＋、p53－／－小鼠，分析第3d和第6d小鼠肺臟組織中TLR家族基因及有關信號通路基因表達變化。發現第3d和第6dTLR8表達發生了明顯上調，這與TLR8主要是抗ssRNA病毒相一致；而第6d時只有TLR2和TLR6發生了上調，可能是在病毒感染后期機體對刺激的反應而引起；對于TLR9在病毒感染第6d時發生了下調，這可能是與TLR9是一種識別細菌的模式識別受體，也暗示TLR9可能與炎癥有關。據報道，TLR9能夠增加IL－1、IL－6、IL－12等的細胞因子的分泌而促進炎癥反應［19－21］，這也與p53抗炎癥反應相符合。在通過對病毒感染后第3 d和第6dTLR信號通路中差異基因的分析表明，NF－κB表達發生了下調而IFN－α表達上調，這可能暗示它們在p53抗流感病毒中起著重要作用；相反地，作為p53靶基因的IRF5和TLR3表達卻沒有發生變化。p53作為轉錄因子，其轉錄作用是在特定的刺激下產生一定的生物學作用，這暗示IRF5和TLR3雖然是p53的靶基因，但在流感病毒感染機體時，p53并不是通過調控IRF5和TLR3的表達而起到抗流感病毒作用的。

本研究通過流感病毒感染p53＋／＋和p53－／－小鼠，采用基因芯片分析了TLR家族成員及相關通路基因表達差異，發現了在p53缺失的情況下，TLR8、TLR9、P13K、P38、IFR7、IL－12、IFN－α、NF－κB等免疫相關基因表達出現異常，顯示了在流感病毒感染過程中，這些TLR信號通路分子的表達直接或間接地受p53的調控，同時，也揭示了p53可能通過調控TLR8的表達和與TLR信號通路中其它基因，如IFN－Ⅰ、NF－κB、TNF等而起到抗流感病毒作用的。

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