多位點(diǎn)PCR用于安徽391株分枝桿菌臨床分離株的快速鑒定＊

包訓(xùn)迪，連璐璐，徐東芳，趙秀芹，董海燕，王 慶，萬(wàn)康林

目前的研究結(jié)果顯示引起人類感染性疾病的分枝桿菌屬種類繁多，包含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）和非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）。MTBC均為高致病菌，主要包括有結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、牛分枝桿菌、卡介苗、M．canettii分枝桿菌、M．caprae分枝桿菌。目前，仍有大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室不能對(duì)分枝桿菌進(jìn)行分型鑒別，導(dǎo)致不能判斷患者中結(jié)核病的真正原因及其感染源、誤診誤治。

傳統(tǒng)分枝桿菌培養(yǎng)、生化試驗(yàn)耗時(shí)（對(duì)于慢生長(zhǎng)分枝桿菌培養(yǎng)需4～8w）、繁瑣（生化試驗(yàn)種類繁多）、不經(jīng)濟(jì)（所需試劑價(jià)格較高），且有時(shí)結(jié)果很難判斷等不足。近年來(lái)，隨著以分子分型技術(shù)為基礎(chǔ)的分子流行病學(xué)的發(fā)展，在研究結(jié)核病病原特征、感染傳播和致病機(jī)制等方面提供了新的檢查手段［1－3］。現(xiàn)在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的菌種鑒定方法有PCR擴(kuò)增IS6110鑒定法，PCR－RFLP鑒定法。但是這些方法存在一定的局限性，如對(duì)IS6110低拷貝（拷貝數(shù)小于5）的菌株難以分型、操作技術(shù)繁瑣、雜交帶識(shí)讀困難等［4］。因此，在本研究中，采用了7個(gè)不同的引物應(yīng)用PCR技術(shù)快速鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群各菌種，為進(jìn)一步菌種鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株來(lái)源 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。分枝桿菌臨床分離株來(lái)源于安徽省結(jié)核病防治所收治及安徽省胸科醫(yī)院的結(jié)核病患者。臨床分離株已依據(jù)《全國(guó)結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［5］，采用L－J培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng)，PNB／TCH鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行初步鑒定。

1．1．2 主要試劑和相關(guān)酶 2×Taq MasterMix、100bp Ladder等PCR相關(guān)試劑購(gòu)于北京康為世紀(jì)公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1．2 方法

1．2．1 DNA的制備 采用水煮法提取DNA模板，用接種環(huán)取L－J培養(yǎng)基菌體，收集于1．5mL螺口離心管中，加入300μL TE，80℃滅活30min；沸水浴15～20min，12 000r／min離心5min；取上清即為模板DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 多位點(diǎn)PCR

1．2．2．1 PCR 引物的選擇 根據(jù) Richard等［6］方法，選擇7對(duì)引物Mtbc l～7，分別對(duì)分枝桿菌16S rRNA 基因、Rv0577基因、IS1561’基因、Rv1510基因、Rv1970基因、Rv3877／8基因及Rv3120基因進(jìn)行擴(kuò)增（表1，2）。

1．2．2．2 PCR擴(kuò)增體系及條件 PCR反應(yīng)體系為：在25μL反應(yīng)體系中，上、下游引物各1μL，2×Taq PCR MasterMix 13μL，DNA模板2μL，純水8μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃10min，變性94℃1min，退火60℃1min，延伸72℃1min，循環(huán)次數(shù)35次，最后充分延伸72℃10min，每次擴(kuò)增分別設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照 。擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像儀下觀察結(jié)果，拍照。

表1 多位點(diǎn)PCR 7對(duì)引物序列［6］Tab．1 Seven primer pairs used in multi－locus PCR

表2 MtbC分型方法Tab．2 Algorithm to identify individual MtbC subspecies

1．2．3 NTM鑒定的PCR擴(kuò)增 由多位點(diǎn)PCR無(wú)法明確鑒定的結(jié)核分枝桿菌，進(jìn)行基因測(cè)序。分別采用引物tb11，tb12［7］和rpoBF，rpoBR［8］（見(jiàn)表3）分別擴(kuò)增hsp65和rpoB，PCR體系為50μL，引物各2μL，2×Taq MasterMix 25μL，DNA模板5 μL，ddH2O 16μL；陰性對(duì)照體系中用ddH2O替代DNA模板，其他不變。PCR條件：預(yù)變性94℃10 min，變性94℃1min，退火60℃1min，延伸72℃1min，30次循環(huán)，最后充分延伸72℃10min。PCR產(chǎn)物由北京擎科測(cè)序。

1．2．4 測(cè)序分析 將hsp65和rpoB測(cè)序序列提交NCBI網(wǎng) 站 （http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi）進(jìn)行同源性比較。待鑒定菌種的DNA序列與參照菌種的同源性≥97%［9］者即可確定菌種。同時(shí)將hsp65測(cè)序序列與GenBank中分枝桿菌hsp65參考序列用DNASTAR軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。

2 結(jié) 果

2．1 多位點(diǎn)PCR結(jié)果 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的凝膠電泳圖譜［6］，結(jié)核分枝桿菌H37Rv 7個(gè)基因位點(diǎn)的電泳條帶均為陽(yáng)性，陰性對(duì)照無(wú)條帶，NTM的擴(kuò)增只有16SrRNA引物有條帶。田鼠分枝桿菌是第l、2、4、6、7號(hào)引物擴(kuò)增有陽(yáng)性條帶 ；M．canettii有第1、2、3、4、5、6號(hào)引物擴(kuò)增有陽(yáng)性條帶；非洲分枝桿菌I型有第1、2、3、4、6、7號(hào)引物擴(kuò)增陽(yáng)性條帶 ；M．caprae分枝桿菌為第1、2、3、4、6號(hào)引物擴(kuò)增有陽(yáng)性條帶 ；牛分枝桿菌為第1、2、3、6號(hào)引物擴(kuò)增有陽(yáng)性條帶；卡介苗為第1、2、3號(hào)引物擴(kuò)增有陽(yáng)性條帶。結(jié)果顯示：391株臨床分離株經(jīng)7對(duì)引物擴(kuò)增，MTB 378株，非洲分枝桿菌I型6株，非結(jié)核分枝桿菌7株，見(jiàn)圖1。多位點(diǎn)PCR鑒定結(jié)果與PNB／TCH鑒定結(jié)果比較，兩者間的符合度達(dá)到98．72%（386／391），見(jiàn)表4。

2．2 NTM鑒定結(jié)果 通過(guò)hsp65和rpoB基因測(cè)序，所得序列提交NCBI網(wǎng)站使用BLAST（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi）進(jìn)行同源性比較。7株非結(jié)核分枝桿菌經(jīng)基因測(cè)序后，同源性均大于97%［9］以上，分別為：1株鳥(niǎo)分枝桿菌（Mycobacterium avium），2株馬賽分枝桿菌（Mycobacterium massiliense），4株胞內(nèi)分枝桿菌（Mycobacterium intracellulare）。

表3 hsp65，rpoB 引物序列［7－8］Tab．3 Primers for hsp65and rpoBused in this study

圖1 不同種分枝桿菌臨床菌株Multi－locus PCR鑒定結(jié)果Fig．1 The results of different Mycobacteriumspecies in clinical strains identified with multilocus PCR in this study1：Standard strain of Mycobacterium tuberculosis H37Rv；2：Negative control；3：AH11020（Mycobacterium tuberculosis）；4：AH11022（Mycobacterium africanumI type）；5：AH11018（non－tuberculosis mycobacterium，NTM）

表4 安徽391株分枝桿菌多位點(diǎn)PCR鑒定結(jié)果與PNB／TCH鑒定結(jié)果比較Tab．4 Comparison on multilocus PCR and PNB／TCH identification results for 391strains of mycobacteria in Anhui Province

3 討 論

多位點(diǎn)PCR方法是一種簡(jiǎn)單，直接，快速，特異性高的PCR分型方法，利用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的特異性引物對(duì)標(biāo)本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性片段進(jìn)行鑒定，可以明確區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的亞型。

在本實(shí)驗(yàn)所選用的7對(duì)引物中，同時(shí)存在于標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv中，非分枝桿菌中僅有引物16S rRNA擴(kuò)增陽(yáng)性。在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，僅有田鼠分枝桿菌的引物IS1561’擴(kuò)增陰性，因此，在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的鑒別中，IS1561’可以作為田鼠分枝桿菌和其他結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的區(qū)別［10］；牛分枝桿菌、卡介苗的引物Rv1510擴(kuò)增陰性，Rv1510可以作為牛分枝桿菌、卡介苗和其他結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種的區(qū)別之一。BCG僅有引物Rv3877和Rv3878擴(kuò)增陰性，在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，Rv3877和Rv3878可以作為BCG區(qū)別于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群其他菌種的特征之一［11］。本研究采用了7個(gè)結(jié)核分枝桿菌各菌種的特異引物，通過(guò)進(jìn)行簡(jiǎn)便的PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，快速的鑒定了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的各菌種，但得到的僅是一個(gè)粗略的結(jié)果，其結(jié)果與國(guó)外文獻(xiàn)［6］報(bào)道一致。選擇這7個(gè)位點(diǎn)在鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的唯一缺陷就是無(wú)法區(qū)分非洲分枝桿菌Ⅱ型和人型結(jié)核分枝桿菌。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相信我們會(huì)得到結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群更多的特異性基因，并將其鑒定得更加精確。

本次研究的7個(gè)結(jié)核分枝桿菌各菌種特異的引物快速地對(duì)分枝桿菌菌種進(jìn)行了初步鑒定，在391株臨床分離株的擴(kuò)增結(jié)果顯示：MTB 378株，非洲分枝桿菌I型6株，非結(jié)核分枝桿菌7株。而PNB／TCH鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群385株，非結(jié)核分枝桿菌6株。兩種方法鑒定結(jié)果有區(qū)別的菌株，采用基因測(cè)序進(jìn)行鑒定；測(cè)序結(jié)果與多位點(diǎn)PCR結(jié)果一致。與傳統(tǒng)的PNB／TCH鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定結(jié)果比較，這種多位點(diǎn)PCR能準(zhǔn)確鑒定到分枝桿菌菌種，且鑒定時(shí)間更短。另外，多位點(diǎn)PCR采用的水煮模板法提取DNA，方法簡(jiǎn)單易行，便于推廣使用。

在我國(guó)結(jié)核病防控策略不斷加大的前提下，結(jié)核病的發(fā)病率并沒(méi)有能夠得到有效的遏制。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定分枝桿菌不僅快速可靠，而且成本低廉，易建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，對(duì)臨床診斷和治療，以及進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查和研究均有重要意義，同時(shí)能夠?yàn)橹贫ㄓ行У慕Y(jié)核病控制和治療策略提供理論依據(jù)。

［1］Meng XH，Kuang TJ，Dong M．Application of multiplex PCR in rapid identification of Mycobacterium tuberculosis and non－tuberculosis mycobacteria［J］．Med J Chin PLA，2007，32（11）：1177－1183．（in Chinese）孟祥紅，匡鐵吉，董梅．應(yīng)用多重PCR方法快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌．解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，32（11）：1177－1183．

［2］Wang X，Zhang YY，Chen BW，et al．Preliminary study on rapid identification the species of mycobacteria by PCR－restriction fragment length polymorphism based upon hsp65gene［J］．Chin J Epidemiol，2009，30（6）：616－618．DOI：10．3760／cma．j．issn．0254－6450．2009．06．019．（in Chinese）王心，張媛媛，陳保文，等．基于hsp65基因的PCR－RFLP用于快速鑒定分枝桿菌菌種的初步研究．中華流行病學(xué)雜志，2009，30（6）：616－618．DOI：10．3760／cma．j．issn．0254－6450．2009．06．019．

［3］Liu JW，Wu XQ，Yang JL．Rapid identification of 130mycobacterial isolates by PCR－RFLP analysis of the hsp 65gene［J］．J Clin Pulm Med．2009，30（6）：616－618．（in Chinese）劉佳文，吳雪瓊，楊京靈．hsp65基因序列PCR－RFLP法鑒定130株臨床分枝桿菌研究．臨床肺科雜志，2006，11（4）：453－454．

［4］Goh KS，Legrand E，Sola C，et al．Rapid differentiation of"Mycobacterium canettii"from other Mycobacterium tuberculosis complex organisms by PCR－restriction analysis of the hsp65gene［J］．J Clin Microbiol，2001，39（10）：3705 3708．DOI：10．1128／JCM．39．10．3705－3708．2001．

［5］Basic Professional Committee of Chinese Antituberculosis Association．The procedure of TB laboratory diagnostics［M］．Beijing：China Education and Culture Press，2006：53－56．（in Chinese）中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)．結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程［M］．北京：中國(guó)教育文化出版社，2006．53－56．

［6］Huard RC，Lazzarini LC，Butler WR，et al．PCR－based method to differentiate the subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex on the basis of genomic deletions［J］．J Clin Microbiol，2003，41（4）：1637－165．DOI：10．1128／JCM．41．4．1637－1650．2003

［7］Telenti A，Marchesi F，Balz M．et al．Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis［J］．J Clin Microbiol，1993，31（2）：175－178．

［8］Kim BJ，Lee KH，Park BN，et al．Differentiation of mycobacterial species by PCR－restriction analysis of DNA （342base pairs）of the RNA polymerase gene （rpoB）［J］．J Clin Microbiol，2001，39（6）：2102－2109．DOI：10．1128／JCM．39．6．2102－2109．2001

［9］Chimara E，F(xiàn)errazoli L，Ueky SY，et al．Reliable identification of mycobacterial species by PCR－restriction enzyme analysis（PRA）－h(huán)sp65in a reference laboratory and elaboration of a sequence－based extended algorithm of PRA－h(huán)sp65patterns［J］．BMC microbiol，2008，8：48．DOI：10．1186／1471－2180－8－48

［10］Cole ST，Brosch R，Parkhill J，et a1．Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence［J］．Nature，1998，393（6685）：537－544．DOI：10．1038／31159

［11］Behr MA，Wilson MA，Gill WP，et a1．Comparative genomics of BCG vaccines by whole－genome DNA microaray［J］．Science，1999，284（5419）：1520－1523．DOI：10．1126／science．284．5419．1520．