福建省鼠傷寒沙門(mén)菌PFGE分子分型和耐藥的關(guān)聯(lián)性研究＊

楊勁松，陳建輝，林 杰，鄭金鳳，嚴(yán)延生，陳愛(ài)平

福建省鼠傷寒沙門(mén)菌PFGE分子分型和耐藥的關(guān)聯(lián)性研究＊

楊勁松，陳建輝，林 杰，鄭金鳳，嚴(yán)延生，陳愛(ài)平

目的 分析福建省鼠傷寒沙門(mén)菌的脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）分子分型和耐藥結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)性，探討二者的內(nèi)在聯(lián)系。方法對(duì)福建省66株鼠傷寒沙門(mén)菌進(jìn)行PFGE分子分型和藥敏試驗(yàn)，并對(duì)分子分型和藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果66株鼠傷寒沙門(mén)菌分為32個(gè)PFGE型，P1、P8型為優(yōu)勢(shì)型別，其中40．9%（27／66）的菌株為P1型，10．6%（7／66）的菌株為P8型，51．52%（34／66）的試驗(yàn)菌株歸于P1和P8型別；耐藥結(jié)果經(jīng)聚類(lèi)分析，可將抗生素分為4類(lèi)，其中頭孢類(lèi)和環(huán)丙沙星（氟喹諾酮類(lèi)）是較高敏感藥物，敏感率分別為94．42%（61／66）和62．12%（41／66）；P1型在多重耐藥嚴(yán)重的菌株中（＞6耐）為優(yōu)勢(shì)型別，占該類(lèi)菌株數(shù)的56．82%，以6耐為分界，P1型菌株在兩組中的分布存在差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P8型菌株在兩組中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論P(yáng)1和P8型是福建省鼠傷寒沙門(mén)菌的PFGE分型的優(yōu)勢(shì)基因型，其中P1型與多重耐藥嚴(yán)重的菌株（＞6耐）間存在關(guān)聯(lián)性；頭孢類(lèi)和環(huán)丙沙星（氟喹諾酮類(lèi)）仍是當(dāng)前治療福建省嚴(yán)重耐藥鼠傷寒菌的主要藥物。

鼠傷寒沙門(mén)菌；脈沖場(chǎng)凝膠電泳；分子分型；耐藥性；關(guān)聯(lián)性

沙門(mén)菌血清型種類(lèi)繁多，1975－2003年在福建省全省50多個(gè)縣 （市、區(qū) ）開(kāi)展了人、動(dòng)物、食品及污水等外環(huán)境沙門(mén)菌血清型分布特征及與疾病關(guān)系的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門(mén)菌是我省最常見(jiàn)血清型之一［1］。近年來(lái)，福建省鼠傷寒菌食物中毒事件屢有發(fā)生，鼠傷寒菌醫(yī)院內(nèi)感染也多次報(bào)道。本研究采集本省2009－2010年鼠傷寒沙門(mén)菌，對(duì)PFGE分型和耐藥結(jié)果進(jìn)行分析，探討PFGE帶型與耐藥譜的關(guān)聯(lián)性，為早期發(fā)現(xiàn)鼠傷寒菌的暴發(fā)流行調(diào)查以及預(yù)測(cè)多耐菌的流行趨勢(shì)提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)菌株 66株鼠傷寒沙門(mén)菌分離自我省2009－2010年沙門(mén)菌感染患者和健康體檢者，均經(jīng)我中心細(xì)菌科復(fù)核鑒定。PFGE標(biāo)準(zhǔn)Marker菌株H9812由全國(guó)病原體監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)PulseNet China提供。1．2 主要儀器 Bio－Rad公司的CHEF MAPPER脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀和Gel Doc XR＋ 凝膠成像系統(tǒng)，Bio Merieux Vitek公司的DENSIMAT細(xì)菌濁度儀。

1．3 主要試劑 沙門(mén)菌診斷血清購(gòu)自泰國(guó)S＆A公司，微量生化管購(gòu)自廣東省環(huán)凱微生物科技有限公司，15種藥敏紙片和水解酪蛋白（MH）瓊脂均購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。Seakem Gold Agarose PFGE級(jí)瓊脂糖購(gòu)自Lonza公司，XbaⅠ限制性內(nèi)切酶以及蛋白酶K購(gòu)自美國(guó)NEB公司。上述實(shí)驗(yàn)材料均在有效期內(nèi)使用。

1．4 藥敏試驗(yàn) 藥敏測(cè)定采用WHO推薦的瓊脂擴(kuò)散法（K－B法），參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS 2005）頒布的抑菌環(huán)直徑診斷標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果，每次試驗(yàn)均采用大腸菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25922作質(zhì)控對(duì)照。

1．5 PFGE實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)PulseNet網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法（美國(guó)CDC）完成66株鼠傷寒沙門(mén)菌的PFGE的脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜。

1．6 數(shù)據(jù)分析 PFGE圖像導(dǎo)入BioNumerics（version 6．0，Applied Maths，Inc）軟件包進(jìn)行處理，選擇Dice相關(guān)系數(shù)和UPGMA方法，tolerance設(shè)置為1．5%。采用SPSS 15．0軟件包對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)抗生素進(jìn)行R聚類(lèi)。胺、甲氧芐啶、復(fù)方新諾明、四環(huán)素。結(jié)果顯示菌株對(duì)頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢噻吩四種藥敏結(jié)果完全一致，即這4種藥對(duì)同一菌株的藥敏結(jié)果相同。將這4種藥合并為頭孢類(lèi)；對(duì)甲氧芐啶、復(fù)方新諾明的藥敏結(jié)果完全一致，將這兩種藥合并為部分磺胺類(lèi)。將15種抗生素歸納為11類(lèi)，66株鼠傷寒沙門(mén)菌11類(lèi)抗生素耐藥譜的菌株分布情況見(jiàn)表1。

2．3 抗生素聚類(lèi)分析 根據(jù)鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)所測(cè)試11類(lèi)抗生素的敏感情況，可將抗生素大致分為4類(lèi)：第1類(lèi)包括頭孢類(lèi)和環(huán)丙沙星，鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)該類(lèi)藥物敏感性高；第2類(lèi)藥物包括氯霉素、部分磺胺類(lèi)和慶大霉素，鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)該類(lèi)藥物敏感性中等；第3類(lèi)包括氨芐西林、四環(huán)素、萘啶酸、鏈霉素和磺胺等藥物，鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)該類(lèi)藥物敏感性較差；第4類(lèi)藥耐藥性中介狀態(tài)較多，如：阿莫西林＋棒酸。

2．4 66株鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥譜的PFGE型別分布情況 66株鼠傷寒沙門(mén)菌中優(yōu)勢(shì)型別P1和P8型菌株共占51．52%，各耐藥組菌株P(guān)FGE型別分布存在差異，其中6耐、7耐、8耐、9耐組中P1和P8優(yōu)勢(shì)型別分布最多，分別為100%（3／3）、61．54%（8／13）、80．0%（16／20）、71．43%（5／7）。具體結(jié)果見(jiàn)表2。其它PFGE型別在各耐藥譜中的分布比較分散。

2．5 耐藥譜與PFGE優(yōu)勢(shì)型別的關(guān)聯(lián)性 將11類(lèi)耐藥譜分為2組，即0～5耐和6～10耐組。各耐藥組中PFGE優(yōu)勢(shì)型別菌株的分布見(jiàn)表3。

2 結(jié) 果

2．1 鼠傷寒沙門(mén)菌PFGE分型結(jié)果 66株鼠傷寒沙門(mén)菌用XbaⅠ酶切并進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳后，DNA片段可得到較好地分離，可見(jiàn)大小不一的電泳條帶，分子量從18～1 162 kb；菌株條帶數(shù)目在12～20之間。利用Bio Numerics軟件的Cluster analysis模塊進(jìn)行聚類(lèi)分析，菌株間條帶相似度在64．8%～100%之間；按照95%的相似度可將菌株酶切圖譜分為32個(gè)PFGE型，其中P1型有27株，P8型有7株，P7、P18型各有2株，其余各型均為1株，P1、P8型為優(yōu)勢(shì)型別，見(jiàn)圖1。

2．2 鼠傷寒沙門(mén)菌藥敏結(jié)果 對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌進(jìn)行15種抗生素的藥敏試驗(yàn)，包括：氨芐西林、阿莫西林＋棒酸、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢噻吩、氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、萘啶酸、鏈霉素、磺

圖1 66株鼠傷寒沙門(mén)菌XbaⅠ酶切聚類(lèi)分析Fig．1 Cluster analysis of 66 S．typhimurium strains with XbaⅠin PFGE test

表1 66株鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥譜情況Tab．1 The drug resistance spectrum of 66 S．typhimurium strains

經(jīng)卡方檢驗(yàn)，χ2P1＝13．821，P1型＜0．001；χ2P8＝2．417，P8型＞0．05，即認(rèn)為P1型菌株在兩組中的分布存在差異，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P8型菌株在兩組中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

本次研究將本省兩年來(lái)搜集的66株鼠傷寒菌進(jìn)行PFGE分型，采用XbaⅠ內(nèi)切酶，按照95%的相似度可將菌株酶切圖譜分為32個(gè)PFGE型，其中P1型有27株，P8型有7株，二者占到總數(shù)的51．52%，為福建省鼠傷寒菌的優(yōu)勢(shì)帶型。本次PFGE試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步深入研究，同時(shí)也為早期發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門(mén)菌的暴發(fā)流行提供基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表2 66株鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥譜的PFGE優(yōu)勢(shì)型別分布情況Tab．2 Distribution of the prevalent PFGE types in drug resistance spectrum of 66 S．typhimurium strains

表3 鼠傷寒沙門(mén)菌各耐藥組PFGE優(yōu)勢(shì)型別分布Tab．3 Distribution of the prevalent PFGE types in two drug resistant groups

隨著大量抗生素的濫用，病原菌耐藥性已成為全球亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)我省監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥率有逐年大幅上升之勢(shì)，耐藥譜迅速增寬，多重耐藥菌株逐年急劇增多。因此，定期進(jìn)行鼠傷寒菌耐藥性監(jiān)測(cè)，掌握其變遷趨勢(shì)，選擇敏感藥物，是控制鼠傷寒菌病暴發(fā)和流行的重要環(huán)節(jié)。謝一俊等［2］對(duì)福建省1980－1995年鼠傷寒沙門(mén)菌進(jìn)行耐藥監(jiān)測(cè)顯示氟哌酸等氟喹諾酮藥物、第3代頭孢菌素（包括大部分1、2代頭孢菌素）和丁胺卡那霉素的敏感率達(dá)100% ，是當(dāng)時(shí)治療福建省嚴(yán)重耐藥鼠傷寒菌的敏感藥物。許學(xué)斌等［3］對(duì)上海市鼠傷寒沙門(mén)菌腹瀉株、食品株、本市食品從業(yè)人員的體檢株進(jìn)行連續(xù)性耐藥監(jiān)測(cè)認(rèn)為：本市鼠傷寒沙門(mén)菌的總體耐藥表型穩(wěn)定，存在DT104等多重耐藥株，并有增多的趨勢(shì)。本次鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥結(jié)果經(jīng)聚類(lèi)分析，可將抗生素分為4類(lèi)，其中頭孢類(lèi)和環(huán)丙沙星（氟喹諾酮類(lèi)）是較高敏感藥物，鼠傷寒菌對(duì)這兩類(lèi)抗生素的敏感率分別為94．42%（61／66）和62．12%（41／66），敏感率出現(xiàn)了一定程度的下降，表明鼠傷寒菌耐藥情況日益嚴(yán)重，與上海市的監(jiān)測(cè)結(jié)果相符，但該藥物仍是當(dāng)前治療福建省嚴(yán)重耐藥鼠傷寒菌的主要藥物。

將PFGE分子分型和細(xì)菌的耐藥譜進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析是本課題的探索性研究，通過(guò)關(guān)聯(lián)性分析以期發(fā)現(xiàn)在耐藥的菌株間是否存在某種特定的PFGE基因型別，根據(jù)PFGE分型能夠及時(shí)預(yù)測(cè)菌株的耐藥流行趨勢(shì)，防控耐藥菌的傳播。本課題兩者關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果提示：P1型在不同耐藥譜中的分布，以6耐為分界，存在明顯的差異，P1型在大于6耐組的分布率及構(gòu)成比均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于6耐以下組，P1型在7耐、8耐和9耐的分布率分別為53．84%、55．0%和57．14%，表明P1型的分布與耐藥譜的級(jí)數(shù)存在一定的關(guān)聯(lián)性。也就是說(shuō)在多重耐藥嚴(yán)重的鼠傷寒沙門(mén)菌中（大于6耐），P1是該組耐藥譜菌株的常見(jiàn)基因型，同時(shí)P8型在各耐藥組的分布率雖然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但構(gòu)成比差異明顯（P8型全部分布在6～10耐組），需要增加樣本例數(shù)才能得到更為準(zhǔn)確的結(jié)論。在實(shí)際工作中，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)FGE帶型屬于P1型則可以推測(cè)該菌株藥敏結(jié)果很可能為多耐（多于6耐）菌株，為預(yù)測(cè)鼠傷寒沙門(mén)菌的耐藥流行趨勢(shì)提供了另一種實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。我們還需不斷加大監(jiān)測(cè)力度，搜集更多菌株以充實(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)，探索P1型、P8型乃至其他PFGE型別與特定耐藥譜的關(guān)聯(lián)性。

［1］謝一俊，鄭國(guó)櫆，陳建輝，等．福建1975－2003年沙門(mén)菌監(jiān)測(cè)結(jié)果分析［J］．海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2004，10（6）：7－10．

［2］Swaminathan B，Barrett TJ，Hunter SB，et al．PulseNet：the molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance，United States［J］．Emerg Infect Dis，2001，7（3）：382－389．

［3］謝一俊，陳亢川，林成水．福建省鼠傷寒沙門(mén)菌病原學(xué)特征研究［J］．海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2002，8（3）：1－3．

［4］許學(xué)斌，金匯明，肖文佳．上海市鼠傷寒沙門(mén)菌流行特征及分子分型研究［J］．上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，22（2）：57－61．

Association between PFGE molecular typing and drug resistance of Salmonella typhimurium in Fujian

YANG Jin－song，CHEN Jian－h(huán)ui，LIN Jie，ZHENG Jin－feng，YAN Yan－sheng，CHEN Ai－ping

（Fujian Center for Disease Control and Prevention，F(xiàn)uzhou 350001，China）

To study the association between PFGE molecular typing and drug resistance of Salmonella typhimurium in Fujian，we carried out PFGE experiment and susceptibility test within 66 strains of S．typhimurium n，and conducted association analysis．The 66 S．typhimurium were divided into 32 PFGE types．A 40．9%（27／66）of them were P1，and 10．6%（7／66）were P8，there were 51．52%（34／66）strains classified into P1 and P8，which were the prevalent types．In the drug resistance test，antibiotics were divided into 4 groups with cluster analysis，in which，cephalosporin and ciprofloxacin（quinolone）were hypersensitive，and the sensitive rates were 94．42%（61／66）and 62．12%（41／66）respectively；P1 was the prevalent type in multidrug resistant strains（more than 6 resistant），amounting for 56．82%of the total．The distribution of P1 had statistical significance between the group“more than 6 strains resistance"and the group"less than 6 strains resistance"，while the distribution of P8 had no statistical significance between these two groups．Therefore，P1 and P8 were the prevalent gene types，and there was relationship between P1 and multidrug resistant strains（more than 6 strains resistance）．At present，cephalosporin and ciprofloxacin（quinolone）are still the main antibiotics to treat Salmonella typhimurium in Fujian．

Salmonella typhimurium；PFGE；molecular typing；drug resistance；association

R117

A

1002－2694（2012）01－0010－04

＊國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)“傳染病監(jiān)測(cè)技術(shù)平臺(tái)”項(xiàng)目（2009ZX10004－210）；福建省衛(wèi)生廳青年基金課題資助計(jì)劃（No．2010－1－23）

陳愛(ài)平，Email：cap2006＠live．cn

福建省疾病預(yù)防控制中心，福州 350001

2011－07－19；

2011－09－28