2010年福建省腸道病毒71型分離株的基因型特征研究＊

陳 煒，周朝暉，張擁軍，翁育偉，謝劍鋒，吳冰珊，王金章，黃 萌，沈曉娜，2，鄭奎城，嚴延生

2010年福建省腸道病毒71型分離株的基因型特征研究＊

陳 煒1，周朝暉1，張擁軍1，翁育偉1，謝劍鋒1，吳冰珊1，王金章1，黃 萌1，沈曉娜1，2，鄭奎城1，嚴延生1

目的全面研究和了解腸道病毒71型在福建省的遺傳背景，分析和探討該型病毒在我省的地理分布特征及傳播特征。方法對2010年福建省9個設區市的50株EV71分離株進行VP1區全長基因序列測定，并對核苷酸序列進行同源性比較及遺傳進化分析。結果2010年福建省50株EV71型分離株的VP1區核苷酸序列全長均為891 bp，核苷酸及氨基酸序列同源性比較，50株EV71型分離株之間的VP1區核苷酸序列同源性為95．4%～100%，編碼蛋白氨基酸序列同源性為97．3%～100%，與2008年阜陽流行株Fuyang17．08－2同源性最高，核苷酸序列同源性為97．1%～99．3%，氨基酸序列同源性為98．7%～100%；VP1區基因遺傳進化分析，與Fuyang17．08－2株進化關系較為接近，同屬于C4a基因亞型。結論2010年福建省50株EV71型分離株均屬于C4a基因亞型，未產生明顯的抗原漂移及變異；福建省及各個地市均分布親緣關系較近的C4a基因亞型的EV71多傳播鏈病毒，應加強長期動態地監測和分析。

腸道病毒71型；VP1區；基因型特征

腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）歸屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus），是引起患者手足口病（Hand，foot andmouth disease，HFMD）的主要病原體，于1969年在美國首次被確認［1］。近年來，西太平洋區多國家個和地區［2］報道了由腸道病毒EV71型為主引起的的手足口病暴發事件，例如1997年馬來西亞［3］，1997、2000 年 日 本［4－5］，1998、2000 年 中 國 臺 灣省［6－7］，1999 年 澳 大 利 亞［8］，2000 年 韓 國［9］和 新 加波［10］，2007 年 我 國 山 東 省［11］，2008 年 我 國 阜 陽市［12］及之后我國大陸地區［13］的暴發流行。

為全面研究和了解腸道病毒71型在福建地區的遺傳背景，繼對福建省1名手足口病患兒標本分離到的EV71型分離株（2010FJLY008）（GenBank ID：HQ426649）進行了全基因組核苷酸序列測定及分析［14］后，本文對2010年福建省9個設區市的50株EV71分離株進行VP1區全長基因序列測定，通過與其它國內外EV71分離株之間的比較、分析，研究和探討腸道病毒71型在我省各個地區的基因型地理分布特征及傳播特征等。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 毒株 本實驗室對2010年福建省9個地市上送的手足口病患兒咽拭子、皰疹液或肛拭子標本進行病毒培養、分離及鑒定，具體方法及結果判定見文獻［15］。并全年階段性挑取腸道病毒EV71型毒株，共計50株，在9個地市均有分布。

1．1．2 試劑 病毒核酸提取試劑盒、一步法RTPCR試劑盒、膠回收試劑盒購于QIAGEN公司（德國）；質粒提取試劑盒購于TIANGEN公司（北京）。TaqDNA聚合酶、p MDTM18－T 載體與DH5α感受態細胞均購于TaKaRa公司。

1．2 方法

1．2．1 病毒RNA提取 采用QIAamp viral RNA mini kit提取病毒RNA，按照試劑盒說明書進行操作。取第2代細胞培養物上清液140μL提取RNA，最終收集50μL的RNA溶液。

1．2．2 VP1區全長基因擴增 以提取的RNA為模板，按照QIAGEN One step RT－PCR試劑盒使用說明書操作，根據文獻所用引物［16］。RT－PCR反應條件：50℃30 min；95℃15 min；94℃30 s，50℃40 s，72℃80 s，35個循環；72℃10 min。擴增產物大小約為1 100 bp，包括VP1區全長基因。

1．2．3 擴增產物的克隆 RT－PCR擴增的產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用QIAquick Gel Extraction Kit回收純化后，分別克隆至p MDTM18－T載體。重組克隆經RV－M和M13－47通用引物鑒定。1．2．4 DNA序列測定和分析 提取的陽性重組克隆質粒送Ta KaRa公司測序。全部核苷酸和氨基酸序列分析和同源性比較應用DNASTAR軟件完成，系統發生樹構建應用Mega 4．0軟件完成。所有參考序列均來自GenBank，見表1。

2 結 果

2．1 病毒VP1區全長基因組片段的擴增、克隆與鑒定 從RD細胞培養上清液提取RNA，以此為模板，利用覆蓋EV71病毒VP1區全長基因組的引物進行一步法RT－PCR擴增，得到覆蓋VP1全長基因組的片段，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，得到約1 100 bp大小的片段。該片段經過回收純化后分別克隆至p MDTM18－T載體。重組克隆經RV－M和 M13－47通用引物鑒定，陽性質粒用于測序分析。共獲得分布于福建省9個設區市的50株EV71型分離株的VP1區全長核苷酸序列。VP1區核苷酸序列全長均為891 bp，未發現有核苷酸的缺失與插入。2．2 核苷酸序列同源性比較 將福建省50株EV71型分離株與來自GenBank的CA16、EV71型代表株進行核苷酸序列同源性比較。50株EV71型分離株與2008年安徽阜陽流行株Fuyang 17．08－2的VP1區核苷酸序列同源性最高，為97．1%～99．3%；與柯薩奇病毒 A16代表株CA16，G－10的同源性最低，為62．2%～63．5%；與其他代表株的核苷酸序列同源性比較，見表2。

根據分離株的地理分布不同，對福建省各個設區市EV71型分離株進行VP1區核苷酸序列同源性比較，見表3。其中，福州市EV71型分離株之間的核苷酸序列同源性較高，為98．0%～100%；南平市EV71型分離株之間的核苷酸序列同源性較低，為95．6%～100%。

表2 福建省EV71型分離株與其他CA16、EV71型毒株VP1區核苷酸序列和編碼蛋白氨基酸序列同源性比較Tab．2 Homology comparison of nucleotide sequence and amino acid sequence among Fujian EV71 strains，and other CA16 and EV71 strains based on VP1 regions

表3 各個設區市EV71型分離株的VP1區核苷酸序列和編碼蛋白氨基酸序列同源性比較Tab．3 Homology comparison of nucleotide sequence and amino acid sequence of EV71 strains in each prefecture based on VP1 regions

2．3 編碼蛋白氨基酸序列同源性比較 EV71型病毒VP1區基因組全長891個核苷酸，共編碼297個氨基酸。將福建省50株EV71型分離株的VP1區編碼蛋白氨基酸序列與來自GenBank的CA16、EV71型代表株的VP1區編碼蛋白氨基酸序列進行同源性比較，見表2。其中，福建省50株EV71型分離株與2008年安徽阜陽流行株Fuyang17．08－2的VP1區編碼蛋白氨基酸序列同源性最高，為98．7%～100%；與柯薩奇病毒 A16代表株CA16，G－10的同源性最低，為71．8%～72．8%。

另外，根據分離株的地理分布不同，對福建省各個設區市EV71型分離株的VP1區編碼蛋白氨基酸序列進行同源性比較，見表3。

2．4 VP1區基因的遺傳進化分析 使用Mega 4．0軟件，通過鄰接法（Neighbor－joining），基于全長VP1區基因，以CA16，G－10為外群，對福建省分離株與其它24株已知基因型的EV71毒株進行遺傳進化分析（圖1）?？梢钥闯?，2010年福建省50株分離株株均集中于C4基因亞型的C4a進化分支。

圖1 EV71病毒VP1區的遺傳進化分析Fig．1 Phylogenetic tree of Vp1 regions in EV71 viruses

3 討 論

目前，VP1基因是EV71分子流行病學主要的研究內容，Obereste等［17］提出：VP1區編碼蛋白含有大量的病毒中和因子，VP1基因具有與病毒血清型完全對應的遺傳多樣性。本研究對2010年分布于福建省9個設區市的50株EV71型分離株進行VP1區基因序列擴增測序，并與GenBank中的EV71型代表株進行比對。VP1區基因序列分析表明，2010年福建省50株EV71型分離株與其他EV71型代表株一樣，VP1區基因全長均為891 bp，未出現核苷酸的缺失和插入。

VP1區基因核苷酸序列及編碼蛋白氨基酸序列同源性比較顯示：2010年福建省50株EV71型分離株之間的VP1區核苷酸序列同源性為95．4%～100%，編碼氨基酸序列同源性為97．3%～100%；2010年福建省50株EV71型分離株與2008年安徽阜陽流行株Fuyang17．08－2的VP1區核苷酸序列同源性最高，為97．1%～99．3%，氨基酸序列同源性為98．7%～100%；詳見表2。比較結果顯示與Brown等［18］提出的EV71型病毒各基因亞型內部之間的差異小于12%的研究結果一致，而與其提出的EV71型病毒3個基因型之間的VP1區核苷酸序列差異在16．5%～19．7%之間和所有EV71型毒株之間的VP1區基因編碼蛋白氨基酸序列同源性大于94%的結論有所差異。根據分離株的地理分布不同，對福建省9個設區市EV71型分離株進行VP1區核苷酸序列及其編碼氨基酸序列同源性比較，詳見表3。比較結果顯示，福州、廈門地區的EV71型分離株核苷酸序列同源性比南平等地區的高。

基于全長VP1區核苷酸序列進行遺傳進化分析被公認為是進行EV71病毒基因型鑒定方法。Obereste等［17］指出：全長VP1區核苷酸序列分析，可作為腸道病毒屬內不同血清型分類的依據，也可以作為小RNA病毒科內不同屬的分類參考。根據Brown等［6］對1970年至1998年在美國及其他5個國家分離的113株EV71型毒株的全長VP1區基因進行了分析，把所有的EV71分為A、B、C 3個基因型。本實驗通過對全長VP1區基因的遺傳進化分析，2010年福建省50株EV71型分離株與Fuyang17．08－2株的親緣關系密切，均屬于C4基因亞型的C4a進化分支，見圖1。從圖中可以看出，福建省9個設區市的分離株均集中在C4a進化分支，但是每個設區市的分離株并非集中分布，而是分散交錯分布于各個不同的簇中，其中福州、廈門地區的分離株較其他地區，分布相對集中，其它地區的分離株分布較為分散。這與福建省9個設區市EV71型分離株進行VP1區核苷酸序列同源性比較結果一致，表明福建省及各個地市均存在親緣關系較近的C4a基因亞型的EV71多傳播鏈病毒。

總之，通過對2010年福建省50株EV71型分離株的基因特征研究，我們發現，2010年福建省50株EV71型分離株均屬于C4a基因亞型，未產生明顯的抗原漂移及變異；福建省及各個地市均存在親緣關系較近的C4a基因亞型的EV71多傳播鏈病毒。然而，日本［4］、中國臺灣［6］等國家和地區報道了EV71病毒流行基因型或亞型在一段時間內會發生改變，而從2007年我國山東?。?1］，2008年我國阜陽市［12］及我國大陸地區［13］包括2008年福建?。?9］，截止目前的EV71病毒流行基因型均為C4a。因此，福建省及中國大陸地區是否存在EV71其它基因型或者在今后流行的基因型或基因亞型是否發生改變，則需要長期動態地監測和分析。

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Genotyping of enterovirus 71 strains isolated in Fujian Province，2010

CHEN Wei，ZHOU Chao－hui，ZHANG Yong－jun，WENG Yu－wei，XIE Jian－feng，WU Bing－shan，HUANG Meng，SHEN Xiao－na，ZHENG Kui－cheng，YAN Yan－sheng
（Fujian Center for Disease Control and Prevention，Fuzhou 350001，China）

Enterovirus type 71（EV71）is a common cause of pediatric hand，foot and mouth disease（HFMD）．The genetic background of current EV71 isolates was investigated，and the distribution and transmission characteristics of EV71 strains in Fujian Province were analysed in this study．The complete VP1 sequences of 50 EV71 strains，isolating from specimens of 50 HFMD patients in Fujian in 2010，were sequenced，homologically compared and phylogenetically analysed．Sequences analysis revealed that the full－length VP1 region of 50 Fujian EV71 strains was 891bp．Within 50 Fujian EV71 isolates，the nucleotide and amino acid identity were 95．4%－100%and 97．3%－100%respectively，sharing high homology with Fuyang 17．08－2 both in nucleotide and amino acid sequences，with the identity of 97．1%－99．3%in nucleotides and 98．7%－100%in amino acids，respectively．Phylogenetic analysis based on complete VP1 sequence also indicated that 50 Fujian EV71 strains had a close genetic relationship with Fuyang 17．08－2，which also belonged to the same subgenotype，C4a．Therefore，no obvious antigenic drift or mutation was observed．However，as closely related subgenotype C4a EV71 have multiple transmission chains in Fujian Province and in each prefecture，extensive surveillance and analysis are required．

Enterovirus 71；VP1 genome；gene characterization

R373．2

A

1002－2694（2012）01－0006－04

＊“十一五”國家科技重大專項“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”（2009ZX10004－106）

沈曉娜，Email：shenxiaona＠fjcdc．com．cn

1．福建省疾病預防控制中心，福州 350001；

2．福建醫科大學醫學技術與工程學院，福州 350004

2011－06－17；

2011－09－25