非小細胞肺癌的BRAF基因突變及其臨床意義

黃志敏 吳一龍

BRAF基因激活突變可發生于多種腫瘤及癌細胞系中，尤其常見于惡性黑色素瘤。近年來研究提示BRAF基因激活突變可能與肺癌的發生發展及治療預后有密切的關系。本文就BRAF基因的結構、表達、信號通路調節及研究熱點、與腫瘤發生的關系尤其是與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的靶向治療關系加以闡述。

1 BRAF基因及家族

BRAF基因，1988年由Ikawa等[1]首先在人類尤文氏肉瘤中發現并克隆確認，是一個能轉染NIH3T3細胞且有活性的DNA序列，因其與CRAF和ARAF具有相當高的同源性，故稱其為BRAF。位于染色體7q34的BRAF基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是RAF家族成員之一，該家族還包括ARAF、CRAF，三者的編碼產物均存在于細胞間質中，其中ARAF蛋白主要位于泌尿生殖器官，BRAF主要位于神經及睪丸組織，CRAF在人體內廣泛分布。BRAF蛋白由783個氨基酸組成，從N端到C端依次為CR1、CR2和CR3三個保守區。其中CR1區由RAS蛋白結合區和富含半胱氨酸區組成，這兩個區域均可與RAS結合；CR2富含絲氨酸/蘇氨酸，為調節磷酸化RAF激酶活性；CR3區為ATP結合位點和激活區，含有酪氨酸和絲氨酸殘基及有多個磷酸化位點，其中T598和S601最為重要，這兩個位點同時磷酸化后可激活BRAF蛋白和誘導性激活ERK[2]，而這兩個位點氨基酸的置換將導致BRAF蛋白持續性活化。

2 BRAF與RAS-RAF-MEK-ERK信號通路

BRAF蛋白與KRAS蛋白同為RAS-RAF-MEK-ERK信號通路中上游調節因子[3]，在MAPK/ERK信號通路中起著舉足輕重的作用。RAS蛋白屬于小GTP結合蛋白，與三磷酸鳥苷GTP及二磷酸鳥苷GDP有很強的親和性，RASGTP為RAS的活化形式，RAS-GDP為非活化形式，二者能夠相互轉化，對細胞分化、增殖起調節作用[4]。酪氨酸激酶受體與生長因子結合，能使酪氨酸蛋白激酶受體二聚化及殘基磷酸化，促使銜接分子Grb2與SOS結合，細胞外信息經此途徑被轉導至細胞內。SOS通過使RASGDP轉化RAS-GTP從而活化RAS激酶活性。RAS-GTP復合物可調節一系列細胞進程，如增殖、生長和分化[5]。RAS可以通過激活至少10條下游反應通路途徑而發揮作用。其中研究比較透徹的是RAF-MEK-ERK通路（經典MAPK通路）。RAS-GTP與其下游效應分子RAF結合，使RAF磷酸化并激活，從而激活了RAF下游信號轉導MAPK級聯途徑。RAF蛋白磷酸化并激活下游底物MEK，而MEK磷酸化并激活下游底物ERK，進而調節細胞內的生物學過程[6]。其中MEK具有磷酸化蘇氨酸/酪氨酸殘基的雙特異功能，ERK為富含脯氨酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。

3 BRAF的分子變異

目前有超過40種BRAF突變被識別[7]，其中最主要有兩種類型，80%突變發生于激酶功能域的V600E（即外顯子15），20%突變位于外顯子11的甘氨酸環。以上兩種突變均可使BRAF激酶活性提高。研究證實V600E突變后能夠產生類似于T598和S601兩個位點磷酸化的作用，使BRAF蛋白持續激活，激活后的BRAF通過下游MEK/ERK傳導通路刺激細胞的增殖和分化。其它一些發生率較低的BRAF基因突變多集中于外顯子11甘氨酸環的突變如R461I、 I462S、 G463E、 G463V、G465A、 G465E、G465V、 G468A、 G468E、 N580S、E585K、 D593V、F594L、 G595R、 L596V、T598I、V600D、V600E、V600K、V600R、K601E、A727V等，也可通過直接激活BRAF而激活MEK/ERK傳導通路[2]。

4 BRAF突變與腫瘤

腫瘤的發生與介導細胞增殖、分化及凋亡的一些關鍵基因的突變有密切關系，RAS信號轉導通路的激活與許多腫瘤的發生有關。BRAF基因突變可通過兩種途徑致病，一是因遺傳而導致先天性缺陷的途徑，二是后天獲得致癌基因而導致腫瘤的途徑。BRAF蛋白與KRAS蛋白同為RAS-RAF-MEK-ERK信號通路中上游調節因子[3]。BRAF在MAP/ERKs信號通路中起著舉足輕重的作用，BRAF蛋白位于MEK/ERK途徑的入口處，它將細胞表面的受體和RAS蛋白通過MEK和ERK與核內的轉錄因子相連接，影響細胞分化、分裂、增殖、生長[3]。BRAF的持續激活可引起MEK/ERK信號轉導紊亂，導致細胞過度增殖、惡變。BRAF基因突變最先在黑色素瘤患者中檢測到，在黑色素瘤、甲狀腺瘤中突變率較多（約80%），而在淋巴瘤、直腸癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌及肺癌中突變率較少[7]。BRAF突變以T1799A點突變即V600E最為常見，T1799A點突變是外顯子15上第1,799位核苷酸T→A的轉換，導致蛋白質產物中第600位的纈氨酸（V）被谷氨酸（E）替代[8]，常見于甲狀腺瘤、直腸癌及黑色素瘤患者。

5 BRAF基因突變與NSCLC

5.1 BRAF突變在NSCLC中的流行病學特點 NSCLC BRAF突變率約為3%[8]，其中大部分是腺癌。一項肺癌小鼠模型[3]表明，NSCLC中存在BRAF的V600E突變表達上調。近來一項研究[9]對697例肺腺癌患者進行EGFR、KRAS與BRAF突變檢測及相關分析，記錄包括患者年齡、性別、種族、腫瘤分期、治療史及吸煙史等臨床特征。其中使用基于質譜分析法的MassARRAY系統（Sequenom, San Diego, CA）對BRAF突變進行分析，識別了3種BRAF突變：V600E（外顯子15）、G469A（外顯子11）、D594G（外顯子15）。與黑色素瘤的BRAF突變80%以上為V600E突變不同，NSCLC的BRAF突變主要為激酶結構域中D594G突變（11%, n=2）及在活化域中甘氨酸環G469A突變（39%, n=7）和V600E突變（50%, n=9）[8]。近年來研究[10]表明，BRAF蛋白可以獨立于RAS蛋白而發生作用。BRAF基因突變與EGFR、KRAS等突變相互獨立、相互排斥且不同時出現[9,11]，在這18例BRAF突變的患者中未檢測到EGFR、KRAS或ALK突變[9]，也佐證了這個說法。BRAF與KRAS基因突變可能發生于腫瘤發生的相似階段，即始動后惡性轉變前，這兩種突變可能在腫瘤的發生作用中是等同的。在生物學上，BRAF突變會使得激酶活性增加，且能使MAPK2、MAPK3結構性活化。近年一項研究[9]提示，與EGFR、KRAS突變多發生于非吸煙肺癌患者不同，BRAF突變多發生于吸煙肺癌患者。

5.2 BRAF抑制劑 目前已經研發出許多BRAF抑制劑。第一代BRAF抑制劑索拉菲尼是首個已有臨床試驗的RAF激酶抑制劑，目前被FDA批準在腎細胞癌和肝細胞癌中使用[5]。它起初被單一認為是BRAF抑制劑，后來發現是CRAF、BRAF、血管內皮生長因子受體、酪氨酸激酶受體等多個激酶的抑制劑，缺乏選擇性。同時索拉菲尼在有著最高BRAF突變率的黑色素瘤的治療中缺乏有意義的臨床活性。在腎癌治療中，積累的經驗也提示索拉菲尼僅用作抗血管生成，而缺乏臨床上BRAF抑制劑的功效[12]。在NSCLC治療中，索拉菲尼作為抗血管形成因子聯合化療使用[13]，同樣也缺乏臨床功效。第二代是以PLX4032為代表的小分子高選擇性BRAF抑制劑，尤其在BRAF基因V600E突變黑色素瘤的III期臨床試驗[14]中取得明顯療效。PLX4032有著高度選擇性，特異性地抑制BRAF（V600E）突變型細胞ERK磷酸化作用，而對BRAF野生型無抑制作用[14]。在BRAF（V600E）突變黑色素瘤模型中以及其異種移植臨床隨訪研究[15,16]中，PLX4032被證實能夠強有力地抑制BRAF信號傳導，包括誘導細胞周期停滯以及細胞凋亡。另外，原發的及繼發的PLX4032耐藥問題有待研究，信號通路的轉換或許是導致耐藥的最可能因素。所以同時抑制多種不同通路的聯合治療或許能保證更好的療效。雖然PLX4032的毒性反應很低，但是在黑色素瘤的治療中其誘發角化棘皮瘤及皮膚鱗狀細胞癌等副作用值得關注[17]。

BRAF在NSCLC中的突變率約為3%，其中半數是非V600E突變，提示NSCLC的BRAF突變從本質上與黑色素瘤不同。然后針對靶向治療藥物治療黑色素瘤BRAF（V600E）突變研究已經比較深入和成熟，而在NSCLC中的療效尚待完善。對BRAF（V600E）突變型細胞高度選擇性的靶向藥物尤其是PLX4032在NSCLC中的作用有待進一步研究，同時也應該注意研發其它高選擇性的靶向治療藥物。

5.3 BRAF基因在NSCLC表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）治療中的預測作用 目前EGFR突變已經被確立為評估EGFR-TKI（吉非替尼和厄洛替尼）治療敏感性的有效預測指標，有效率高達70%[18]。一項針對未經治療的轉移性NSCLC患者的前瞻性隨機對照III期研究（Iressa Pan-Asia Study, IPASS）[18]發現，吉非替尼一線治療比順鉑輔助化療對EGFR突變陽性的肺癌患者擁有更長的無進展生存期。與EGFR突變預測TKI療效陽性價值相反，BRAF突變預示抗EGFR靶向治療的耐藥性。癌基因BRAF能使細胞對EGFR-TKI產生耐藥。檢測BRAF臨床功效的回顧性分析[19]表明西妥昔單抗及帕尼單抗對BRAF突變的患者無效。

6 總結

在腫瘤治療進入基于分子標志物的“個體化”醫學時代，需要對腫瘤細胞攜帶的復雜基因突變進行系統的分子分型。近年來對NSCLC研究熱點，更多地著重于對基于特異的基因突變的NSCLC臨床相關分子事件的進一步細分。BRAF突變在NSCLC中的意義越來越受到廣大學者的關注。

2002年英國腫瘤基因組計劃的科學家Davies等[8]對來自于530個不同腫瘤細胞株的基因組DNA進行篩查，首次在人體內證實有43株細胞發生了BRAF基因突變，且在所有腫瘤中的發生率是8%，而在歐洲人群中肺癌中是3%。在一項針對非白種人的研究[20]中，日本肺腺癌患者BRAF突變僅有1%。近年來研究提示癌基因BRAF能使細胞對EGFR-TKI產生耐藥。

繼續對BRAF基因突變進行深入研究可望為闡明NSCLC致病的分子機制以及尋找新的治療方法提供思路，為研究NSCLC的分子靶向治療提供理論依據。其對于NSCLC的進展及預后的意義尚不明確，其能否作為NSCLC TKI治療耐藥判斷的有效手段，尚待進一步研究證實。