直接電位法研究鉛離子與牛血清白蛋白的相互作用

江書慶，信建豪，竇運修

（黃河科技學院 醫學院，河南 鄭州 450063）

鉛是一種嚴重危害人類健康的重金屬元素，是出現在人類文明社會中最嚴重的環境污染物之一，它可以影響人類的各類器官，如神經、造血、消化、泌尿、生殖、心血管、內分泌、免疫、骨骼等［1］。鉛中毒問題既是一個古老的問題，又是一個探索不盡的新問題。進入體內的物質要通過血漿貯存與運輸才能達到受體部位產生作用，而血清白蛋白可與許多內源和外源性物質結合以形成血清白蛋白的傳輸功能［2］。

牛血清白蛋白（BSA）是一種球蛋白，具有緊湊的橢圓結構，其原始結構的穩定性主要來自疏水作用。它對大多數小型離子和分子具有很高的親合力，為了表征小離子或分子與蛋白質的結合作用，通常研究小離子或分子與牛血清白蛋白的結合。研究小離子或小分子與牛血清白蛋白的結合的常用實驗方法有直接分光光度法［3］、凝膠過濾方法［4］、熒光光度法［5］和平衡透析法［6］等。直接分光光度法和熒光光度法測定時誤差較大，而凝膠過濾法和平衡透析法測定的準確度雖然較高，但是操作起來耗時太長。直接電位法不受溶液的顏色、濁度等影響［7］，具有高選擇性、高準確度、快速、方便等優點，用以研究小離子與BSA結合，具廣闊的應用前景，但現階段國內外研究較少［8］。

1946年Klotz等人在研究有機陽離子如甲基橙、氮磺胺噻唑與BSA相互作用時，推導出Klotz方程［6］，方程形式如下：

其中，r為被BSA結合的離子的摩爾數與BSA的總摩爾數的比值，［L］為自由離子的平衡濃度，K為內在分解常數，n為最大結合數。該方程用于直接電位法測定鉛離子與BSA的最大結合數和結合平衡常數，獲得較好的結果。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

pHS－3CT型精密酸度計（上海大普儀器有限公司）；PXSJ－216型離子活度計（上海雷磁儀器有限公司）；鉛離子選擇性電極（上海電光器件廠）；217型雙接界甘汞電極（內充0.1mol／L的KNO3溶液）；恒速磁力攪拌器（深圳天南海北有限公司）。牛血清白蛋白（BSA）（上海博世化學品有限公司，相對分子量：66，000）；pH5.0的醋酸緩沖溶液；Pb2＋標準溶液：用Pb（NO3）2固體先配制成0.1mol／L的溶液，將該溶液逐級稀釋，并在稀釋過程中加入緩沖溶液和NaCl作為離子強度調節劑，使pH和離子強度恒定。得到一系列Pb2＋標準溶液備用。其它試劑為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 電極電位的測量方法

鉛離子選擇性電極使用之前先在1.0×10－3mol／L的Pb（NO3）2溶液中浸泡活化48h，用水沖洗后與217型甘汞電極組成測量電池，連接離子活度計，測量水的空白電位值，待其穩定后即可測量試液。

1.2.2 Pb2＋與BSA相互作用分析

準確稱取0.0660gBSA于7個10mL容量瓶中，分別加入1.0mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL、0.1mL的10－2mol／L Pb（NO3）2標準溶液，并分別加入計算量的緩沖溶液和NaCl作為離子強度調節劑，使其pH值和離子強度與標準溶液相同，并定容后搖勻。將該系統轉移到25mL的燒杯中，在攪拌器上恒速攪拌10min后，用鉛離子選擇性電極和參比電極組成的測量電池測量其電位。

2 結果

2.1 電極Nernst響應曲線

利用方法“1.2.1”依次測量該電極在1.0×10－7～1.0×10－2（mol／L）的Pb（NO3）2溶液中的電位值E，以電位E對Pb（NO3）2濃度（moL／L）的負對數pC作圖，見圖1。實驗表明在Pb（NO3）2濃度為1.0×10－2～2.0×10－6moL／L范圍內，E～pC具有良好的線性關系。在該濃度范圍內用線性回歸計算出該曲線的線性方程為：E＝－61.13＋28.58pC，Nernst響應斜率為28.58mV／pC，相關系數為0.9993。

2.2 結合位數與平衡常數的計算

圖1 鉛離子選擇性電極的Nernst響應曲線

2.3 實驗條件的優化

為了使測定結果更加準確和穩定，測試液的pH和離子強度經過精確調節，并用磁力攪拌器恒速攪拌，此時鉛離子選擇性電極所檢測信號的重現性良好，平均相對偏差不大于1.3%（n＝4）。

圖2 鉛離子與BSA相互作用

鉛離子與BSA的結合速度較快，使用鉛離子選擇性電極監測鉛離子與BSA結合過程，實驗表明10min后電位達到了恒定，證明10min后鉛離子與BSA結合達到了平衡。所以實驗選擇10min作為相互作用時間。

2.4 干擾實驗

利用鉛離子選擇性電極測定溶液中其他組分的選擇性系數用以證明這些組分是否會對測定產生干擾，實驗表明，溶液中存在的各組分的選擇性系數均小于10－4。證明該體系無明顯干擾。

3 結論

本實驗與文獻［9］進行比較，其結果出入較大。原因可能在于熒光分析中，雖然以靜態猝滅為主，但動態猝滅可能同時存在，造成結果誤差。直接電位法檢測的是自由鉛離子的濃度，其他組分干擾較小，結果可能更加準確。

［1］王蟹，徐輝碧，屠任覆，等.生命科學中的微量元素（下卷）［M］.北京：中國計量出版社，1992：566－5881.

［2］ULRICH KH.Molecular aspects of ligand binding to serum albumin［J］.Pharmacol Rev，1981，33（1）：17－53.

［3］OHYOSHI E，HAMADA Y，NAKATA K，KOHATA S.The interaction between human and bovine serum albumin and zinc studied by a competitive spectrophotometry［J］.Journal of Inorganic Biochemistry，1999，75（12）：213－218.

［4］YOUNG D A B，CIMASONI G.Gibbs－donnon and adsorption effects in the study of the binding of fluoride to albumin by gel filtration［J］.Biochemicaet Biophysica Acta，1974，342（15）：333－342.

［5］YAN WANG，YAN CHENG，HONG FANG SUN.Interaction of nicotine and bovine serum albumin［J］.Chinese Chemical Letters，2000，11（3）：247－250

［6］KLOTZ I M，WALKER，F M，PIVAN R B.The binding of organic ions by proteins［J］.Journal of American Chemical Society，1996，68（15）：486－1490.

［7］汪世花，馬軍霞.離子選擇電極示蹤技術及其應用與展望［J］.勘察科學技術，2001，12（5）.

［8］EROL AYRANCI，OSMAN DUMAN.Binding of fluoride，Bromide and iodide to bovine serum albumin studied with ionselective electrodes［J］.Food Chemistry，2004，84（5）：539－543.

［9］吳根華，汪春華.熒光法研究Pb2＋與牛血清白蛋白的相互作用［J］.光譜學與光譜分析，2005，18（2）.