亞抑菌濃度頭孢西丁體外誘導大腸埃希菌耐藥轉移

韓 珍 林日文 李 靜

廣東省惠州市職業病防治院 516000

超廣譜β－內酰胺酶（ESBLs）是一種新的β－內酰胺酶（BIA），主要產生于大腸埃希菌和克雷伯菌屬，能水解三代頭孢菌素和單環酰酶類（氨曲南），并被BIA抑制劑（如克拉維酸）所抑制，ESBLs的產生和播散給臨床感染的治療帶來極大挑戰。本研究旨在觀察亞抑菌濃度頭孢西丁誘導產ESBL大腸埃希菌臨床分離株體外耐藥質粒接合轉移率及接合子MIC的變化，探討亞濃度頭孢西丁對產ESBL大腸埃希菌耐藥質粒接合轉移率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源：（1）15株產ESBL大腸埃希菌臨床分離株由溫州醫學院附屬第二院細菌室痰標本中分離。質控菌株：ATCC 25922購自衛生部臨床檢驗中心。（2）受體菌：大腸埃希菌（E.coli）C600 SMR Lac菌株（由浙江大學附屬第一醫院俞云松教授惠贈）。

1.1.2 頭孢西丁購于中國藥品生物制品鑒定所，配置成5 120μg／ml的儲存液；鏈霉素購自山東魯抗醫藥股份有限公司（產品批號：060609），氨芐青霉素購自石家莊制藥集團公司，均配置成0.1g／ml的儲存液。

1.1.3 培養基Muller－Hinton肉湯：MH瓊脂為英國OXOID公司產品，購自廣州市樂通泰生物科技有限公司；LB液體培養基配制：蛋白胨10.0g、酵母浸出粉5.0g、NaCl 10.0g加H2O至1 000ml用5mol／L NaOH調pH至7.2～7.4，121℃15min滅菌。其中胰蛋白胨和酵母浸膏為Difco公司產品，氯化鈉為廣州化學制劑廠產品。含氨芐青霉素和鏈霉素LB平板的制備：LB固體培養基高壓后冷卻至56℃左右，加入氨芐青霉素（終濃度為50.0μg／ml）和鏈霉素（終濃度為1.0mg／ml），立即至無菌的超凈臺上灌制LB平板。（200ml LB固體培養基加100μL 0.1g／ml氨芐青霉素，2ml 0.1g／ml鏈霉素）。含鏈霉素LB平板的制備：LB固體培養基高壓后冷卻至56℃左右，加入鏈霉素（終濃度為1.0mg／ml），立即至無菌的超凈臺上灌制LB平板（200ml LB固體培養基加2ml 0.1g／ml鏈霉素）。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定及藥敏試驗：全部實驗菌株經VITEK全自動微生物系統鑒定，藥敏試驗按照2007NCCLS推薦紙片擴散法進行。

1.2.2 ESBLs的判斷：用頭孢他啶（30μg）及頭孢他啶／克拉維酸（30μg／10μg）組合、頭孢噻肟（30μg）及頭孢噻肟／克拉維酸（30μg／10μg）組合，各紙片相距至少24mm貼于M－H平板上，在35℃孵浴24h后測量抑菌環，任一組藥物的抑菌環的直徑差≥5mm時判斷ESBLs為陽性。

1.2.3 頭孢西丁的MIC測定：按照2007NCCLS推薦的微量肉湯稀釋法確定頭孢西丁的MIC值。（1）微量藥敏板的制備：將頭孢西丁儲存液用M－H肉湯按1∶40倍稀釋成濃度為128μg／ml，取200μL到12×8孔板的每排第1孔中，2～10孔中各加入100μL M－H肉湯，從第1孔取100μL到第2孔中倍比稀釋，以后每孔連續稀釋下去，一直到第10孔，最后100μL液體去掉不用，使終濃度為0.25μg／ml。第11孔加100μL不含藥的M－H作為陽性對照，第12孔加不含藥的M－H肉湯200μL作為空白對照。（2）菌液制備：挑單個菌落懸于1.8ml無菌生理鹽水中，菌液濃度為0.5麥氏濁度，再1∶10倍稀釋后備用。（3）從1～11孔中各加入5μL菌液，37℃過夜培養后觀察結果。（4）結果判定：未見細菌生長的最低藥物濃度為該藥對細菌的最低抑菌濃度（MIC）。

1.2.4 接合試驗：采用肉湯接合法：（1）分別挑取產ESBL大腸埃希菌和大腸桿菌C600單個菌落于1.8ml LB肉湯中，菌液濃度為0.5麥氏濁度。（2）取50μL產ESBL大腸埃希菌菌液和500μL大腸桿菌C600菌液到一管4.5ml LB肉湯中。另外單獨取500μL大腸桿菌C600菌液到另一管4.5ml LB肉湯中37℃培養4h。（3）接管中取100μL菌液1∶ 100倍稀釋后涂布于含氨芐和鏈霉素的平板上，另一管中取100μL菌液1∶100 000倍稀釋后涂布于含鏈霉素的平板上，37℃過夜培養后計算菌落數。（4）藥物誘導：在接合前分別用不同濃度的藥物（1／2、1／4、1／6、1／16MIC）對供體菌進行不同時間（2、4、6、8、10h）的誘導后，用LB肉湯洗滌細菌兩次以去除抗生素后用同樣方法進行結合試驗和計算菌落數。

1.2.5 接合轉移頻率的計算［1］：接合轉移頻率＝（接合子菌落數／ml）／（受體菌菌落數／ml）。

1.2.6 接合子特性研究：對接合子進行菌株鑒定、藥敏試驗、ESBL表型篩選和確證試驗，頭孢西丁的MIC測定，方法同前。

2 結果

2.1 ESBL確證試驗陽性結果如圖1所示。

圖1 ESBL陽性結果

2.2 供體菌產ESBL大腸埃希菌頭孢西丁的MIC值為2μg／ml。

2.3 接合成功的結果如圖2所示。在含氨芐和鏈霉素的LB固體平板上，供體菌和受體菌都未生長，而接合子可以生長；在含鏈霉素平板上計數受體菌的個數。

圖2 接合結果

2.4 頭孢西丁在不同亞抑菌濃度和不同時間的誘導后，接合轉移率結果見表1和圖3所示。可見頭孢西丁在0.25μg／ml（1／8MIC）濃度時誘導4h的接合轉移率最高，1μg／ml（1／2MIC）濃度在任何時間的誘導后都比相應不誘導的接合轉移率低。

2.5 不同亞抑菌濃度頭孢西丁在不同時間誘導后各接合子對頭孢西丁MIC值見表2所示。可見經藥物誘導后所有接合子頭孢西丁的MIC值均比原供體菌高。

3 討論

細菌只能通過非常有限的方式獲得耐藥基因：

表1 頭孢西丁在不同亞抑菌濃度和不同時間誘導后的接合轉移率

圖3 頭孢西丁在不同亞抑菌濃度和不同時間誘導后的接合轉移率

表2 各接合子MIC值

單個基因的突變，或一種新基因的獲取。后者一般通過基因的轉化或接合轉移引起。通過突變引起的耐藥基因的出現比較慢，自發突變引起的細菌耐藥發生的頻率為每有機體10－6～10－10，而耐藥基因轉移引起的頻率為每有機體10－1［2］。因此，病原菌中接合性DNA的轉移是耐藥性播散的主要原因，了解耐藥質粒的接合轉移機制對控制其播散是必要的。

本研究發現使用1μg／ml頭孢西丁進行誘導時，細菌耐藥性接合轉移率有所下降，說明1／2MIC的藥物作用時，有抑制耐藥質粒轉移的作用，既可以抑制耐藥性的播散。但隨著藥物濃度的進一步減低，接合轉移率會漸漸升高，在1／8MIC時的結合轉移率達到最高，說明頭孢西丁在1／8MIC濃度下對產ESBL大腸埃希菌耐藥性轉移的影響最大，即可引起耐藥性的播散。該結果與國外報道的1／4MIC～1／8MIC值的四環素是誘導脆弱擬桿菌對四環素耐藥轉移的最佳濃度一致。耐藥基因的播散可能由用于人類衛生保健和動物飼料抗生素的過度使用及越來越多的侵襲性設備和操作的使用引起。另外，大量的易感宿主和感染控制的錯誤治療也能增加耐藥菌的傳播。本研究中還發現經藥物誘導后，細菌對該誘導藥物的最低抑菌濃度都有所升高，說明藥物誘導能引起耐藥性的增加。與國內［3］和國外文獻報道的都相符。說明了亞抑菌濃度的藥物可以引起細菌耐藥性的增加和耐藥性的播散，從而大大增大了治療的難度。因此，制定控制大腸埃希菌對抗生素產生耐藥性的策略迫在眉睫。

控制大腸埃希菌耐藥性，首先，要嚴格控制與耐藥菌出現有關的抗生素的濫用，避免無抗菌藥物指征時或完全預防性用抗菌藥物，避免過量使用抗菌藥物，避免無針對性用藥，了解當地耐藥性的流行趨勢和耐藥譜，合理的選擇用藥劑量。其次，不限制低潛在耐藥性的抗生素的使用，不使用無效的抗生素，積極研制開發新型抗菌藥物，開發不使用抗生素或抗菌藥物來治療感染的治療策略（如使用中藥消除耐藥質粒，用疫苗從根本上消滅細菌感染性疾病）。第三，抗生素的使用周期不宜過長，可以循環應用不同的抗生素，Raymond DP等［4］報道抗菌藥物的循環應用可明顯降低與感染相關的病死率及院內感染的發生率；第四，經驗性治療及時轉變為目標性治療［5］。最后，嚴格執行消毒隔離措施，防止交叉感染。對付細菌耐藥性問題，除了沿用傳統思路尋找新的抗菌藥物外，更應該從現有相關科學研究領域發展的新角度去思考，解決耐藥性問題的策略。

［1］ Victor Lorian.Antibiotics in laboratory medicine〔M〕.Baltimore Williams ＆Wilkins，1996：483－484.

［2］ LeClerc JE，Li B，Payne WL，et al.High mutation frequencies among Escherichia coli and Salmonella pathogens〔J〕.Science，1996，274（5290）：1208－1211.

［3］ 陳瑞，唐英春，等.亞抑菌濃度亞胺培南體外誘導銅綠假單胞菌耐藥〔J〕.中華醫院感染學雜志，2005，15（2）：131－133.

［4］ Raymond DP，Pdletier SJ，Crabtree TD，et al.Impact of rotating empiric antibiotic schedule on infectious mortality in an intensive care unit〔J〕.Crit Care Med，2001，29：1101－1108.

［5］ Niederman RA，Michael S.Appropriate use of antimierobial agents：challenges and strategies for improvent〔J〕.Critical Care Medicine，2003，31（2）：1608－1616.

（本文通訊作者：韓珍）

（編輯 羽飛）