血清/血漿microRNAs作為肺癌診斷標記物的研究進展

張輝 綜述 陳曉峰 審校

近年來隨著肺癌發病率與死亡率的逐年上升，肺癌已成為最具有致命性的惡性腫瘤之一。據美國癌癥學會發布的一項數據顯示，2010年美國確診肺癌患者約22.2萬人，約15.7萬人死于肺癌，位居因惡性腫瘤死亡人數的首位[1]。在我國肺癌也已成為位居首位的癌癥死因[2]。在所有肺癌中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）約占85%[3]。雖然目前仍沒有非常有效的治療手段，但早期NSCLC的治療已取得較大的進步，其中以手術為主的綜合治療可以明顯延長I期NSCLC患者的生存期，5年生存率達到45%-65%[3]。因此早期發現肺癌可以減少肺癌的死亡率，但是目前還沒有一種非常安全有效的方法對肺癌高危人群進行篩查，以往的肺癌標記物如細胞角蛋白21-1、腫瘤多糖、癌胚抗原診斷肺癌的敏感度較低[4]。有研究[5,6]報道影像學檢查發現的肺部結節，大約50%是良性的，對減少肺癌死亡率作用有限。此外，超聲氣管內鏡下活檢、肺穿刺活檢為有創檢查方式。

MicroRNAs（簡稱miRNAs）是一類高度保守、長度很短的非編碼調控單鏈RNA，約20 nt-24 nt，通過與目標mRNA互補配對導致mRNA降解或抑制轉錄后翻譯誘導基因沉默[7]。MiRNA參與生命過程中一系列的重要進程，包括發育、造血、器官形成、凋亡和細胞增殖，以及癌癥的發生、發展，其通過切割靶mRNA或抑制靶mRNA翻譯實現miRNAs抑制基因表達[8]。最近研究發現，血清/血漿中有大量穩定存在的miRNA，并且可作為肺癌的診斷標記物。

1 血清/血漿miRNA的穩定性

在血清/血漿中存在大量的核糖核酸酶，那么miRNA是否可以逃脫核糖核酸酶的消化？對此Chen等[9]、Mitchell等[10]2008年報道血清中的miRNA可以耐受核糖核酸酶的消化。Ho等[11]報道血漿miRNA在100oC的環境下也可保持穩定性。他們將血漿煮沸20 min后提取miRNA，然后測量miRNA的表達量，發現與對照組相比miRNA表達量沒有明顯變化。此外Taylor[12]、Huang[13]、Gilad[14]等報道在4oC和室溫下miRNA也可保持穩定性。還有研究[9-11,14]報道miRNA經反復凍融和在強酸（pH=1）、強堿（pH=13）的環境中也可穩定存在。

血清/血漿miRNA保持穩定性的機制仍不清楚，目前主要有兩種觀點。一種觀點認為分泌到血液中的miRNA是以被膜包繞的囊泡狀結構存在的，被稱之為外核體（exosomes）或微泡（microvesicles），通過此結構可以有效保護血清/血漿中的miRNA不被核糖核酸酶消化，并且可以將miRNA運輸到靶細胞，從而發揮調節功能[15-17]。另一種觀點認為血清/血漿miRNA以蛋白復合體的形式存在[18]。Arroyo等[19]報道，循環中的miRNA可以被蛋白酶破壞，失去穩定性，進一步研究發現Argonaute2（Ago2）蛋白在該復合體中起著重要作用，因此將循環中的miRNA稱之為Ago2-miRNA蛋白復合體。

目前關于血清/血漿miRNA的各種功能機制研究的仍比較少，關于血清/血漿miRNA是如何進入血液、在血液中如何運輸以及如何進入靶細胞發揮作用仍不是很清楚，這一系列的問題需要進一步的研究。

2 血清/血漿miRNA的檢測方法

目前許多研究[20-23]通常使用75 μL-1.5 mL的血清/血漿抽提miRNA。Kroh等[24]報道用400 μL的血清/血漿抽提miRNA，不僅方便操作，也可抽提出滿意的miRNA濃度。目前主要有兩種方法提取血清/血漿miRNA，一種是Trizol法，另一種是濾柱法。因Trizol中含有苯酚、異硫氰酸胍等物質，能迅速破碎細胞并抑制細胞釋放出的核酸酶，并且能在破碎和溶解細胞時保持RNA的完整性，可以用于直接從細胞或組織中提取總RNA。當前使用最多的是濾柱法，在使用濾柱法時因血清/血漿中含有大量的蛋白質，通常在抽提前需要使用苯酚-氯仿處理樣本，以去除蛋白質，防止在抽提過程中大量蛋白阻塞濾柱而大量損耗miRNA。對于檢測miRNA的表達量，Northern blot是金標準，但是由于其靈敏度較低并且操作方法較繁瑣，一般不用于對臨床樣本的檢測[25]。實時熒光定量RT-PCR是檢測血清/血漿miRNA表達量的常用方法。根據反轉錄引物的不同，實時熒光定量RT-PCR可以分為莖環狀引物法和多聚腺嘌呤加尾法。研究報道使用莖環狀引物法可以獲得更高的反轉錄效率和特異度。此外，根據化學發光原理的不同，還可分為熒光染料法和探針法。探針法在檢測的特異度和靈敏度方面優于染料法。此外高通量序列分析法[28]和芯片法也用于對miRNA的檢測，但由于高通量序列分析法價格較昂貴，一般只用于探尋新的miRNA，而芯片法由于重復性較差，一般只用于miRNA的初篩。

今后隨著檢測技術的不斷發展，需要建立一套標準化的血液樣本收集、運輸保存以及miRNA提取制備和實時熒光定量RT-PCR檢測技術體系以及數據處理系統，確保miRNA檢測結果的標準化。

3 血清/血漿miRNA在肺癌診斷中的應用

Keller等[29]報道肺癌患者的血清miRNA表達譜在確診為肺癌之前就已發生了改變。在此項研究中共收集到29份血清，其中6份來自6位健康志愿者，另外23份來自已確診為肺癌的8例患者。在這23份血清中，有15份是在臨床確診為肺癌之前收集到的。他們使用芯片法分析了這29份血清miRNA的表達譜，發現血清miRNA表達譜可以在很長的時間里保持穩定，但越接近確診為肺癌的時間點，miRNA的表達譜變化越明顯。

此外，Boeri等[6]將血漿miRNA與螺旋CT對肺癌的早期診斷進行了對比。研究者使用螺旋CT對吸煙者進行了肺癌篩查，并且收集了確診為肺癌時以及確診為肺癌之前的血漿。發現當螺旋CT未報告異常時，使用血漿miRNA對肺癌進行診斷，敏感度和特異度分別為80%和90%。而當螺旋CT報告異常時，血漿miRNA對肺癌診斷的敏感度和特異度達到75%和100%，研究還發現某些血漿miRNA與肺癌患者的預后相關。

Chen等[4]報道使用10種血清miRNA聯合診斷NSCLC的敏感度和特異度分別達到93%和90%。為了獲得血清中差異表達的miRNA，研究者使用實時熒光定量RT-PCR技術檢測了200例NSCLC患者和110位健康志愿者血清中的miRNA，篩選出10種miRNA，并在另外200例NSCLC患者和110位健康志愿者中對這些血清miRNA的表達差異情況進行了驗證。發現使用這10種miRNA聯合診斷NSCLC的敏感度和特異度分別為93%和90%。此外他們還使用這10種血清miRNA在2,000名體檢者中進行了NSCLC篩查，發現使用這10種血清miRNA對NSCLC進行篩查，可以得到較好的檢出率。

此外，Foss等[23]報道血清miR-1254和miR-574-5p可以用于早期NSCLC的診斷，研究者使用芯片技術檢測了11例NSCLC患者和11位健康志愿者的血清miRNA表達譜，發現有4種miRNA的差異表達倍數達到了1.54倍。然后在另外的22例NSCLC患者和31位健康志愿者中對這種差異表達情況進行了驗證。發現血清miR-1254和miR-574-5p聯合診斷早期NSCLC的價值最高，敏感度和特異度達到73%和71%。另外Shen等[20]也報道了血漿miRNA-21、miRNA-126、miRNA-210、miRNA-486-5p可以聯合診斷I期NSCLC。他們通過測定早期肺癌組織中的miRNA表達譜明確了12種miRNA與早期NSCLC有關，然后在28例I期NSCLC患者的肺癌組織和血漿中對這些miRNA進行了篩選，并在另外58例NSCLC患者和29例健康志愿者的血漿中對篩選得到的miRNA進行了驗證，發現這12種miRNA中有5種差異表達水平在血漿與肺癌組織中是一致的，并且通過Logistic回歸模型進一步發現有4種miRNA（miR-21、miR-126、miR-210、miR-486-5p）對診斷I期NSCLC的敏感度和特異度達到最高（分別為73.33%和96.55%），并且還發現這些miRNA診斷肺腺癌的敏感度（91.67%）明顯高于肺鱗癌（82.35%）。

Wei等[22]報道血漿miRNA-21可以作為NSCLC的診斷標記物，并且還發現血漿miRNA-21的表達水平與肺癌的TNM分期相關，在T3-T4患者血漿中miRNA-21的表達水平高于T1-T2患者，III期-IV期患者的表達水平高于I期-II期患者的表達水平。使用血漿miRNA-21診斷NSCLC的敏感度和特異度分別為76.2%和70%。此外，還發現在使用以鉑類藥物為基礎的化療患者中，達到部分緩解的患者血漿中miRNA-21的表達水平明顯低于達到穩定和進展患者的表達水平。

另外Roth等[30]報道肺癌患者血清miRNA-10b、miRNA-34a、miRNA-141、miRNA-155的表達水平明顯高于健康者，并且還發現肺癌患者血清miRNA-10b、miRNA-141、miRNA-155的表達水平高于肺部良性病變患者的表達水平，肺癌患者血清中miRNA-10b的高表達與肺癌的淋巴結轉移相關。

4 問題與展望

綜上所述， miRNA在血清/血漿中不僅可以穩定存在，并且可以耐受各種極端環境的影響。在其穩定性的基礎上，利用它在肺癌患者和健康者中表達譜的不同，可以將肺癌患者篩選出來，以更早地診斷肺癌，降低肺癌的死亡率。但是目前看來，利用血清/血漿miRNA診斷肺癌還存在一個重要問題：血清/血漿中缺少合適的內參基因作為對照。對此已有學者提出疑問[31]，他們認為由于缺乏合適的內參基因作為對照，很可能造成實驗組與對照組實驗數據之間不具有可比性，因此利用血清/血漿中的miRNA診斷肺癌并不合適。此外，由于目前文獻報道的用于抽提miRNA的血清/血漿量的不同以及抽提方法和定量方法的不同，造成了相關文獻報道的用于診斷肺癌的miRNA不同。因此在后續的研究中希望可以找出合適的內參基因作為對照，并建立起使用血清/血漿miRNA診斷肺癌的標準化程序，促進血清/血漿miRNA在肺癌診斷中的應用。