非小細胞肺癌podoplanin陽性淋巴管密度與多層螺旋CT表現的關系

周暉 熊曾 劉進康 陳勝喜 周漠玲 劉洋騰宇

影響可切除性原發性非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者生存最重要的因素是淋巴結的轉移，目前有研究[1]表明腫瘤微淋巴管密度（lymphatic microvessel density, LMVD）與淋巴結轉移有關，但對它與影像學的關系還了解不多，本研究用免疫組化的方法檢測34例NSCLC患者手術標本內微淋巴管特異性標志物podoplanin的表達，分析其與NSCLC淋巴轉移及肺癌結節多層螺旋CT（multi-slice spiral computed tomography,MSCT）表現的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2005年12月-2009年3月我院經MSCT掃描、肺癌切除術和病理證實的NSCLC病例34例，均為肺內單發結節，結節直徑2.0 cm-3.0 cm；患者術前未行化療或放療等抗腫瘤治療，在CT掃描后1周內手術；其中男性25例，女性9例；年齡44歲-73歲，平均58.3歲；按第7版AJCC肺癌TNM分期標準，p-TNM分期I期12例，II期9例，III期13例。組織學分類：鱗癌15例，腺癌（含肺泡細胞癌）15例，腺鱗癌4例。病理證實無淋巴結轉移15例，有淋巴結轉移19例。高分化9例，中分化12例，低分化13例。

1.2 CT掃描和征象分析 采用Philips公司Brilliance型16層螺旋CT機。掃描范圍自腎上腺水平至肺尖，平靜呼吸下屏氣時掃描。主要技術參數為：120 kVp，100 mAs-250 mAs，探測器組合16 mm×1.5 mm，螺距值0.6-0.9，重建層厚2 mm，重建間隔1 mm，重建矩陣512×512。原始圖像數據傳輸到工作站（MXV Philips）后，以結節為固定中心進行多平面重建技術（multiplanar reconstruction, MPR）操作，利用多種窗技術顯示結節內部及結節-肺界面情況。利用表面遮蓋法（shaded surface display, SSD）、最大密度投影法（maximum intensity projection, MIP）、容積再現技術（volume rendering technique, VRT）等三維成像技術進一步觀察病灶形態與周圍結構關系，多種后處理技術的結合利用更全面、立體、準確的評價結節的CT表現特征[2]。由2位具有5年以上胸部CT閱片經驗的放射科診斷醫師以雙盲法按統一標準評價病灶的MSCT征象，存在分歧時通過協商達成一致。本研究納入的MSCT征象分析指標參照國內外文獻公認的標準[3]，選取能有效反映結節的生物學特征并被廣泛認同的以下指標：①邊緣形態（毛刺、淺分葉、深分葉、棘狀突起）；②結節內部結構（空泡征、實性結節、部分實性結節）；③結節鄰近結構（胸膜凹陷征、血管聚集征、阻塞性表現、癌性淋巴管炎）。MSCT圖像上測量肺門及各組縱隔淋巴結的短徑，短徑若＞1 cm則判為淋巴結腫大。

1.3 免疫組織化學染色及結果判斷 將已取到的腫瘤組織經4%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，厚4 μm連續切片制備涂膠白片供HE染色和免疫組織化學染色備用。行常規HE染色，觀察惡性結節病理形態學變化并根據2004年WHO肺癌組織學分類標準[4]進行分類和分級。使用試劑為鼠抗人podoplanin單克隆抗體（克隆號：H2907，美國Santa Cruz公司）、兔抗人血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）抗體（克隆號：SP28，北京中杉金橋生物技術有限公司）、鼠抗人增殖細胞核抗原（proliferation cell nucler antigen, PCNA）抗體（克隆號：PC10，北京中杉金橋生物技術有限公司）。實驗方法嚴格按照說明書操作，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化氫連接（SP）二步法進行免疫組織化學染色顯示腫瘤微淋巴管。以鄰近的正常肺實質內的微淋巴管為陽性內對照，并參照試劑訂購公司提供的陽性結果照片，PBS代替一抗為空白對照。腫瘤微淋巴管判斷標準及微淋巴管密度計數方法參照Weidner等[1,5,6]報道的方法并加以改進，LMVD分中心區（結節最大層面的中心部分，測量點距腫瘤中心的距離占腫瘤半徑的50%），周圍區（中心區以外距結節邊緣2 mm-3 mm以內的環狀區域），計數時先在低倍鏡（×100）下觀察全層腫瘤組織，確定區域內微淋巴管密度最大的“熱點”，每區隨機抽取4個熱點，保證每個計數區域采樣均勻，每張切片共讀取8個熱點。于200 mm×0.74 mm視野下人工計數熱點的微淋巴管數目，取其平均值為各區域的LMVD。鄰近的正常肺實質內的微淋巴管不做計數對象，只作內對照評價免疫組織化學染色。所有標本的計數由2位經驗豐富的病理科醫師在不同的時間計數3次，選擇2次相同或相近數目的平均數。VEGF、PCNA表達結果判斷采用文獻通用的方法[7,8]。

1.4 統計學分析 以SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料統計結果均以Mean±SD表示；若各組方差齊同，樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗或單因素方差分析；若方差不齊且無法校正，用t秩和檢驗；多個指標的相關分析采用Spearmen相關分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺結節CT表現及三維重建技術 橫斷位原始圖像結合三維重建技術能全面、細致地表現出肺結節形態特征，更直觀地顯示病灶與周圍組織結構的空間立體關系（圖1A-圖1D）；毛刺征19例；淺分葉9例，深分葉25例；棘狀突起10例；空泡征6例；實性結節25例，部分實性結節9例，未發現非實性結節；胸膜凹陷征28例；血管聚集征24例；阻塞改變（阻塞性肺炎或節段性不張）5例；癌性淋巴管炎16例；34例肺結節內均未見空洞及脂肪。

2.2 肺癌微淋巴管密度與CT表現 Podoplanin陽性表達的淋巴管多數位于NSCLC組織的邊緣區，少數位于鱗癌巢周緣、腺癌的癌間質內。癌組織中心區淋巴管數目較少，大部分擴張不明顯，可閉塞成條索狀；癌周組織淋巴管密度增多，大部分不規則明顯擴張且管壁結構不完整，圍繞癌組織成環狀分布（圖1D-I）。周圍區LMVD（17.6±3.7）高于中心區LMVD（10.0±2.8）（P＜0.001）。存在病理性淋巴結轉移組肺結節的周圍區（20.2±3.5）明顯大于無淋巴結轉移組（15.5±2.0）（P=0.008），存在病理性淋巴結轉移組肺結節的中心區LMVD（10.2±3.7）與無淋巴結轉移組（9.8±1.8）無明顯差異（P=0.062）；有淋巴結腫大和無淋巴結腫大兩組之間各區域LMVD均無明顯差異（P均＞0.05）。Spearmen相關分析顯示淋巴結轉移與肺門、縱隔淋巴結腫大無關（P＞0.05）；周圍區LMVD與VEGF表達強度、PCNA陽性率均正相關，相關系數分別為0.600、0.570（P均＜0.01）；中心區LMVD與VEGF表達強度和PCNA陽性率均不相關（P均＞0.05）。

肺癌結節MSCT表現與腫瘤組織LMVD關系見表1。有棘狀突起征組、有胸膜凹陷征組、有癌性淋巴管炎組的周圍區LMVD均高于無此征象組的周圍區LMVD，組間差異有統計學意義；實性結節組和部分實性結節組之間及有毛刺征組、有分葉征組、有空泡征組、有血管聚集征組、有阻塞病變組與無此表現組周圍區LMVD比較，組間差異無統計學意義；中心區LMVD在各表現不同組之間差異均無統計學意義。

3 討論

惡性腫瘤主要通過血道和淋巴道形成遠處轉移，是影響療效和患者死亡的重要原因，但大部分惡性腫瘤最初發生的轉移并不是通過血管，而是淋巴道[9]。目前對于肺癌結節CT表現與腫瘤生物學特征相關的研究多集中于血管生成方面，本研究使用已被證實具有良好特異性的淋巴管內皮細胞標志物podoplanin[1,10]來檢測腫瘤LMVD，探討肺癌結節MSCT表現與腫瘤淋巴管生成之間的關系。

表 1 肺癌結節MSCT表現與腫瘤組織podoplanin陽性LMVD關系Tab 1 The relationship between CT characteristics and podoplanin-LMVD

圖 1 57歲男性右上肺NSCLC患者。MSCT橫軸位（A）顯示毛刺征，MPR技術顯示分葉征和結節后下方阻塞病變（B）、胸膜凹陷征和棘狀突起（C），VRT技術顯示血管聚集征（D）。組織病理HE染色：低分化腺鱗癌（×200）；免疫組化PCNA、VEGF染色均呈強陽性表達（×200，F，G）；podoplanin染色見中心區微淋巴管稀少（×400，H），癌間質內少量podoplanin表達（×400，H），周圍區微淋巴管較多，管腔擴大且不規則（×400，I）。Fig 1 NSCLC found in the right upper lobe of a 57-year-old male. Axial images of MSCT shows spicules (A), MPR shows lobulated sign and distal side obstructive change (B), pleural indentation, and spinous process (C), VRT shows vessel convergence (D). HE staining of histopathology: poorly differentiated adenosquamous carcinoma (×200); Strongly positive expressions of PCNA, VEGF (SP×400, F, G); Lymphatic microvessels in the central areas were rare (podoplanin, SP×400, H), podoplanin were also expressed in few tumor stromata (SP×400, H), lymphatic microvessels in the peripheral areas were more with irregular and enlarged lumina (podoplanin, SP×400, I).

腫瘤淋巴管生成是指在腫瘤原位形成新的毛細淋巴管，由于腫瘤新生淋巴管結構特殊，使得腫瘤細胞更容易進入淋巴管道形成轉移[9,10]。我們的研究結果顯示NSCLC組織中的微淋巴管主要存在于周邊區域，中心區域淋巴管較少而且多呈閉塞狀態，而周圍區微淋巴管大部分不規則明顯擴張且管壁結構不完整；分區域計數LMVD后與淋巴結轉移關系分析結果顯示與淋巴結轉移有關的是周圍區LMVD，中心區LMVD與淋巴結轉移無關。Liang等[11]的研究也認為淋巴道轉移主要是通過癌周區微淋巴管內皮細胞的開放和癌細胞對淋巴管管壁的破壞而進入淋巴管管腔的。相對于單純的橫斷位圖像，MSCT多種后處理技術的綜合運用能更好的顯示肺癌病灶內部結構、邊緣形態及與周圍結構的關系[2]，本研究顯示MSCT圖像提示周圍區LMVD較高的表現包括有棘狀突起、胸膜凹陷征、癌性淋巴管炎，而肺癌的MSCT征象均與中心區LMVD無關。以上結果提示與轉移相關的功能性淋巴管主要分布在腫瘤組織周邊，而出現棘狀突起、胸膜凹陷征、癌性淋巴管炎的表現提示腫瘤淋巴管生成旺盛，具有更高的淋巴結轉移風險。

我們前期研究發現微血管構筑表型的網狀結構調控腫瘤血管新生與腫瘤增殖[7,12]，本研究還發現周圍區LMVD既和VEGF表達強度正相關又和PCNA陽性率正相關。目前普遍認為VEGF家族通過VEGF/VEGF-R2途徑誘導血管形成，而通過VEGF-C/VEGF-D/VEGF-R3途徑誘導淋巴管形成[13,14]。近年來有研究[15,16]表明VEGF除了明顯促進血管新生之外還有較強的促淋巴管生成和促淋巴結轉移作用，VEGF和VEGF-C均是強大的內皮調控因子，可以誘導腫瘤內微血管和微淋巴管內皮細胞增殖，兩者之間可能存在協同作用[13,14,17]。VEGF是微血管和淋巴管通透性增高的主要因素，VEGF表達越高，微血管和淋巴管內皮細胞連接越松散[15]，因此越容易發生癌細胞的轉移。PCNA的表達是評價細胞增殖能力的主要指標，這些細胞同時包括腫瘤細胞、血管內皮細胞和淋巴管內皮細胞，從而可以評價腫瘤細胞誘導血管和淋巴管新生的能力。本實驗結果表明微血管構筑表型的網狀結構不僅調控血管新生與腫瘤增殖，同時也調控淋巴管生成。

我們的研究還分析了淋巴結腫大與轉移的關系，結果顯示兩者無關，而且有淋巴結腫大和無淋巴結腫大兩組之間各區域LMVD均無明顯差異，合并肺炎或患有增殖性病變均可導致淋巴結腫大，而沒有腫大的淋巴結可能已有轉移。因此，術前僅靠淋巴結形態學的檢查來判斷是否存在轉移有一定的誤差，提示我們還需要結合肺癌淋巴管生成狀態來對淋巴結轉移的風險進行綜合評價。本研究發現棘狀突起、胸膜凹陷、癌性淋巴管炎等MSCT表現與腫瘤淋巴管生成有一定的相關性，出現這些征象的肺癌可能生長活躍、惡性程度高、較容易出現淋巴結轉移，該結果可為無創性評估腫瘤淋巴管生成狀態提供有意義的參考。