腫瘤基因靶向治療中的啟動子研究

郭龍江 吳雅清

華僑大學分子藥物學研究所 分子藥物教育部工程研究中心， 福建泉州 362021

腫瘤基因靶向治療中的啟動子研究

郭龍江 吳雅清

華僑大學分子藥物學研究所 分子藥物教育部工程研究中心， 福建泉州 362021

利用腫瘤特異性啟動子調控治療基因在腫瘤細胞中的表達，是實現腫瘤靶向性基因治療以及提高轉導效率的重要手段和有效途徑。腫瘤特異性啟動子可耦聯溶瘤基因、抑癌基因、自殺基因以及siRNA/MicRNA等，特異性調控這些基因在腫瘤治療中殺死或誘導癌細胞凋亡，或抑制其生長，而對正常細胞影響非常小，從而達到特異性治療的目的。

基因治療；腫瘤；特異性啟動子；靶向治療

研究證明，通過基因轉移的靶向性、突變基因的原位修復、基因表達的時相性、基因表達的靶向性等調控手段，可解決基因治療的靶向性和安全性不足的問題[1]。腫瘤特異性啟動子（tumor specific promoter，TSP）可特異地調控靶基因在癌細胞中表達，增強靶基因的表達效率和特異性，從而提高癌基因治療的靶向性和安全性。

1 啟動子的概念及研究意義

運用特定的基因表達調控元件，使目的基因特異地在腫瘤細胞中表達，從而避免對正常細胞的損傷，是實現腫瘤基因治療靶向性的重要手段之一[2]。啟動子是遺傳區域的上游調控單元，每個基因在5’磷酸末端具有一個啟動序列作為轉錄起始位點，它是結合RNA聚合酶啟動mRNA轉錄的重要條件之一。研究表明，啟動子需要由特定的轉錄因子激活才能具有活性，啟動子具有組織特異性調控功能。pGL6-Basic為無啟動子的含有蟲熒光素酶（luciferase，Luc）報告基因的質粒，pRL-tk為含有tk啟動子調控的海洋腔腸熒光素酶（Renillaluciferase，RL）報告基因的質粒，在pGL6-Basic基礎上重組目的啟動子序列后，與pRL-tk共轉染靶細胞后，然后用雙熒光檢測系統測定轉染細胞裂解液中Luc和RL活性，后者的活性反映每孔細胞的轉染效率，Luc/RL的比值則可反映目的啟動子的相對活性。

2 腫瘤特異啟動子

2.1 人端粒酶逆轉錄酶啟動子（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）

hTERT蛋白在90%以上的腫瘤組織中表達升高，而在正常組織中卻很難檢測到，與其他啟動子相比，hTERT更具廣譜性和安全性。端粒酶在幾乎所有的人類腫瘤細胞中具有高活性，因此很早就有研究者用hTERT啟動子取代控制腺病毒復制必需基因E1A的啟動子來調控病毒在體內特異性復制，從而達到靶向治療的目的[3]。最近Crystal等[4]利用hTERT啟動子偶聯吲哚-3-甲醇的端粒酶基因阻滯人類乳腺癌細胞的G1期細胞周期。Jessica等[5]利用hTERT啟動子調控新型腺病毒裝載的GFP-TRAIL融合蛋白表達，靶向不同人類腦膜瘤和膠質瘤細胞，從而起到了靶向治療的效果。

2.2 凋亡抑制蛋白（survivin）

Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的成員，同樣在眾多腫瘤檢測到高表達。Yuh-Pyng等利用survivin啟動子調節BikDD基因靶向抑制了原位肺癌細胞的生長，延長了實驗動物生存期，實驗證明這一方案是高效且安全的，具有肺癌臨床治療前景。

2.3 甲胎蛋白啟動子（alpha-fetoprotein，AFP）

AFP是腫瘤標志物，正常時由卵黃囊及胚胎肝產生，出生1年后維持低水平，肝病時升高，明顯增高見于肝細胞性肝癌和畸胎瘤，70%的肝癌患者血清中此種蛋白質的水平升高。利用AFP啟動子介導tBid協同化療藥物（5-氟脲嘧啶）對小鼠原位肝腫瘤模型進行試驗，發現Ad/AFPtBid能夠抑制Hep3B腫瘤生長，而與5-氟脲嘧啶聯合用藥則效果更加明顯[6]。同時Cao等[7]利用AFP啟動子與E1A啟動子結合調控攜帶TRAIL基因的溶瘤腺病毒表達，實現了體內肝癌基因靶向治療，從而證明AFP在癌基因治療中特異性啟動子的應用前景。

2.4 神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）

NSE是烯醇化酶的一種同功酶，目前，NSE被公認為人小細胞肺癌（human small cell lung carcinoma cells，SCLC）的最有價值的腫瘤標志物之一[8]。Xu等分別對不同長度NSE啟動子在神經膠質瘤細胞中活性進行定量研究，發現1.8 kb的NSE具有最高活性。應用HSV-TK/GCV自殺基因系統，Tanaka等證明了NSE啟動子在人小細胞肺癌具有高調控活性，利用單純皰疹病毒Ⅰ型胸腺嘧啶核苷激酶（HSV1-TK）基因/丙氧鳥（GCV）系統，其通過調節單純皰疹病毒胸苷激酶表達將抗病毒核酸類似物前藥GCV磷酸化，從而抑制DNA合成、導致細胞死亡。

2.5 骨鈣素（osteocalcin，OC）

OC是一種由成骨細胞合成的非膠原蛋白，文獻證明在原發性骨肉瘤、軟骨肉瘤中廣泛表達。Johnson等[9]報道OC啟動子通過維生素C和D3協同作用誘導，可以靶向不同類型的腎細胞癌基因治療。Shirakawa T等報道OC啟動子和PSA啟動子在雄性激素陰性和陽性前列腺癌細胞中均具有高活性，能夠調控毒性基因殺死前列腺癌細胞。

2.6 其他

深入地研究腫瘤特異啟動子，越來越多的腫瘤特異性標志物基因啟動子被證明具有特異性及高效性。癌胚抗原（CEA）啟動子可控制或增強融合自殺基因單純皰疹病毒胸苷激酶（HSVTK）在CEA陽性癌細胞中的專一性表達和殺傷作用[10]；insulinoma associated 1（INSM1）是一類含有鋅指結構的轉錄因子，INSM1啟動子可靶向小細胞肺癌[11]；毛細血管擴張性共濟失調癥突變蛋白（ataxia telang-iectasia mutated，ATM）是一種激酶，Palmieri等[12]報道高遷移率族蛋白A可促進ATM啟動子活性，從而達到高效特異啟動子的目的。此外還有環氧合酶（Cox-2）、分泌白細胞蛋白酶抑制劑（SLPI）、轉錄因子家族成員E2F啟動子等都是近年來新發現的具有腫瘤特異性啟動子[13]。

3 腫瘤啟動子優化及應用

3.1 啟動子優化

研究發現腫瘤特異性啟動子仍然存在著許多不足，例如某些啟動子雖然具備特異性，但活性太低，而某些啟動子雖然活性高卻是廣譜的，缺乏安全性，所以需要對啟動子進行優化和改造，提高其使用價值。啟動子核酸序列的長短是優化手段之一，活性越高，堿基長度越短的啟動子更具使用價值，Xu等研究NSE啟動子時，發現NSE啟動子時，就NSE不同長度的序列活性進行對比，最終發現1.8 kb的NSE具有最高活性。其二在原有啟動子序列上增加調控元件，例如將增強子重組到特異性啟動子表達載體中以增加啟動子在腫瘤中的活性[14]。在PSA啟動子上添加增強子明顯提高了其調控的綠色熒光蛋白在前列腺癌中的表達效率。嵌合啟動子是啟動子優化的重要手段之一，研究表明嵌合啟動子能夠彌補單一啟動子特異性及安全性方面的不足。hTERT啟動子和缺氧敏感的缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）啟動子嵌合，可調控裝載有SEA基因的腺病毒靶向治療膀胱癌[15]。Takuya等提出TTS啟動子系統，將hTERT啟動子和人肺表面活性物質相關蛋白（human surfactant protein A1）嵌合，發現相對于別的癌細胞以及正常細胞，TTS在肺癌中具有明顯的高效性及特異性。隨后Takuya在原有的TTS系統上插入Bid構建TTS/Bid系統，證明了TTS對癌細胞的具有明顯的殺傷效應[16]。IGF2-P4啟動子和H19啟動子組合在癌細胞中也表現出高活性，隨后作者又證明了IGF2-P3和IGF2-P4啟動子組合具有膀胱癌特異性[17-18]。借助放射線照射、腫瘤局部的缺氧、四環素等一些外在因素也可以優化啟動子，提高其活性。

3.2 啟動子的應用

抗腫瘤效應則是由病毒復制產生，因此復制必須在腫瘤細胞，以保護正常細胞不被損壞。腫瘤特異性啟動子是一種高效的工具用于減少腫瘤基因治療中對正常組織的損害，已有眾多研究將啟動子用于特異性突變或者遞送前藥酶基因的表達調控，并取得了很好的效果。Udono等[19]利用特異性啟動子hTERT構建了腫瘤特異性條件復制病毒表達系統，用于癌癥靶向治療。腫瘤特異性啟動子可用于遞送前藥酶，如HER-2啟動子可調控HSV-TK/GCV自殺基因系統殺傷前列腺癌細胞[20]。通過RNAi技術調節與腫瘤發生發展相關基因的表達可制定出一系列有效的抗癌策略，應用腫瘤特異性啟動子如HRAS啟動子引導針對某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或短發夾（shRNA）表達，從而達到特異性殺傷腫瘤細胞的目的[21]。將啟動子構建到攜帶有治療基因如細菌毒素基因、用于基因治療的細胞因子、凋亡基因TRAIL等的載體上，直接調控治療基因的表達是啟動子應用最直接的方法。

腫瘤特異性啟動子研究，為腫瘤基因治療效率及安全性問題開辟了一個新的有效研發途徑，但是腫瘤特異性啟動子仍然存在著許多不足，特異性和高效性尚未得到徹底的解決，人工啟動子是否具有潛在危險性有待進一步驗證，啟動子的優化和修飾比較繁瑣，技術條件要求高，迄今為止還沒有一個行之有效的方案供人們參考，目前的方案還有待完善。在腫瘤特異性啟動子研究中需要尋找新的效果更為顯著腫瘤特異性啟動子，探索更有效的啟動優化方案及更有臨床前景的啟動子應用方法。

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Study on specific promoters for tumor target gene therapy

GUO Longjiang WU Yaqing
Institute of Molecular Medicine, Huaqiao University Engineering Research Center of Molecular Medicine, Ministry of Education,Quanzhou 362021,China

By using the tumor specific promoter to regulate related gene expression at tumor cell is one of the best approaches to achieve tumor targeting gene therapy and improve transduction efficiency.TSP could be coupled with oncolytic,tumor suppressor genes,antisense nucleic acids,suicide gene and siRNA/ MicRMA etc,then specific regulate them to induce the apoptosis of tumor cells, kill them directly,or inhibit their proliferation without toxicity to normal cells.

Gene therapy;Tumor;Specific promoters;Targeted therapy

R730.5

A

2095-0616（2012）05-49-03

2012-03-01）