針刺結合抗癇靈對癲癇大鼠海馬GABAA R的影響

孫 麗，馮鐵為，李敬孝

(1.大慶龍南醫院齊齊哈爾醫學院附屬第五醫院，黑龍江大慶163453;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱150040;3.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040)

癲癇是大腦神經元突發性異常放電導致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病，發生機制迄今尚未完全闡明。抗癲癇西藥有明顯的毒副作用等局限性。近年有研究表明，中醫藥及針灸有緩效、作用時間長、毒性反應和副作用少的優勢，本實驗通過針藥結合觀察對戊四氮(PTZ)致癲癇大鼠癲癇發作強度的影響，以及癲癇海馬區的GABAAR的表達變化。為中醫藥治療癲癇提供進一步的科學依據。

1 材料和方法

1.1 動物分組

實驗動物采用4～6周健康雄性Wistar大鼠50只，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。體重180～220 g，隨機分成5組。空白組6只，癲癇模型組、抗癇靈處理組、針刺結合抗癇靈處理組、丙戊酸鈉(VPA)處理組各11只。

1.2 癲癇動物模型及給藥方法

每日固定時間予除空白組以外其余大鼠進行腹腔注射戊四氮(PTZ，購于Sigma公司)造模，PTZ用生理鹽水配成2 mg/ml溶液，劑量以亞致痙量35.0 mg/kg為標準。癲癇模型組和空白組大鼠均予以相應劑量生理鹽水灌胃，抗癇靈組、VPA組分別給予相應藥物灌胃，其中抗癇靈為導師李敬孝臨床常用治療癲癇的有效方劑，藥物組成為穿山甲、乳香、沒藥、龍骨、珍珠、膽南星、石菖蒲。針刺結合抗癇靈組每日定時灌胃給藥1次，按照動物穴位定位［1］，針刺百會穴快速進針，留針30 min，運動區［2］，取雙側采取橫刺快速進針，在30 min內捻針3次，每次1 min，頻率為200轉/min以上，30 min以后出針。隔日1次。各實驗組大鼠給予相應灌胃6周時間。實驗期間各組均以普通飼料及自由飲水。灌服藥物的劑量按正常成人(70 Kg)與大鼠給藥劑量系數0.018折算：臨床丙戊酸鈉用量一般為20～30 mg/kg，取其中間值25 mg/kg的劑量，折算成大鼠的灌胃劑量為15.75 mg/kg。

1.3 癲癇發作行為觀察

觀察每只大鼠出現癲癇發作的潛伏期、持續時間、癲癇發作的強度，每只大鼠ipPTZ后觀察2 h。大鼠癲癇發作評分標準［2］：0級：無行為上的發作反應;Ⅰ級：節律性點頭或頭面部抽動;Ⅱ級：陣攣性咀嚼或點頭甩尾;Ⅲ級：頭部顫搐加前肢陣攣性抽搐;Ⅳ級：袋鼠姿勢或多肢抽動;Ⅴ級：全面性持續強直-陣攣發作。造模大鼠連續出現5天Ⅱ級以上癲癇發作者，證明造模成功。在大鼠造模成功后，停止PTZ腹腔注射。

1.4 Western blot方法檢測大鼠海馬中的GABAAR相對表達

經過蛋白提取后，確定蛋白質的不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳，取待測樣品與6×樣品緩沖液按1：5混勻后于沸水浴中煮沸5 min，置室溫冷卻。轉膜印跡在避光條件下，加入堿性磷酸酶的特異性底物溶液，直至出現清晰的特異性條帶。立即將膜浸入去離子水中，漂洗幾分鐘。經圖像分析系統進行光密度掃描分析。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠一般狀態觀察

在實驗進行期間，模型組死亡1只，抗癇靈組死亡2只。到實驗結束時各組大鼠為：空白組6只、模型組10只、VPA組11只、抗癇靈組9只、針刺結合抗癇靈組11只。在治療結束后，各組大鼠體重、手色與空白組相比，無明顯差異。

2.2 行為觀察

在腹腔注射戊四氮7天后，各組大鼠均有出現癲癇發作，呈Ⅱ、Ⅲ級發作為主要表現，個別發作達V級。在造模進入第4周后，癲癇發作平均持續時間又有明顯的延長，表明大部分大鼠已造模成功。見表1。

表1 戊四氮誘導41只大鼠癲癇發作行為觀察(s)

表1 戊四氮誘導41只大鼠癲癇發作行為觀察(s)

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從實驗中觀察到大鼠Ⅳ～Ⅴ級發作時的潛伏期和持續時間明顯比在Ⅰ～Ⅲ級發作時的潛伏期和持續時間長。在Ⅳ～Ⅴ級發作時潛伏期均在2～10 min之間，持續時間在0.5～3 min之間，在Ⅰ～Ⅲ級發作時的潛伏期均在2～30 min之間，持續時間在15～60 min。

2.3 大鼠海馬中的GABAAR蛋白相對表達比較

表2 各組大鼠腦組織中海馬GABAAR蛋白表達比較(s)

表2 各組大鼠腦組織中海馬GABAAR蛋白表達比較(s)

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表2示：模型組大鼠海馬中GABAAR蛋白陽性表達顯著降低，與空白組比較具有顯著性差異(P＜0.01);VPA組、抗癇靈組、針刺結合抗癇靈組的GABAAR蛋白陽性表達較模型組增加，差異性顯著(P ＜0.05)。

3 討論

癲癇在中醫學中稱為“癇癥”，俗稱“羊癲風”。中醫學理論有對癲癇的病因病機的明確闡述，既有先天稟賦不足引起，也有后天失養或產傷、顱腦外傷、情志失調病因，導致心、肝、脾諸臟受損，產生風、火、癖、痰病理產物使氣血逆亂，風火相煽，走竄經絡，痰凝氣滯，蒙閉清竅，引起癲癇發作，以風、火、痰為主，多屬實證;病久不愈，反復發作，正氣損傷，由實轉虛，多為虛中夾實之證。正氣虛，風痰氣滯，病邪深入，病情反復難愈，治療亦較困難。抗癇靈沖劑由穿山甲、乳香、沒藥、龍骨、珍珠、膽南星、石菖蒲組成。通過用藥配伍有豁痰、化瘀、開竅、鎮驚、安神、熄風功效，針對癲癇的病因病機癥狀治療。筆者曾先期做過系列抗癇靈的實驗研究，結果顯示：抗癇靈可有效的對抗戊四氮致癲癇大鼠癲癇發作強度，顯著降低氨基丁酸轉氨酚合成前體谷氨酸(GLu)受體n一甲基天冬氨酸受體(NMDA)的活性，從而可治療和控制癲癇發作。現代醫學研究表明癲癇的發病機制復雜，是腦內抑制性神經遞質Y-氨基丁酸(GABA)與興奮性神經遞質谷氨酸和/或天門冬氨酸(Glu/ASp)作用失衡，破壞中樞神經元突觸傳遞所至。γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經系統最具有代表性的抑制性神經遞質，在神經元興奮性的改變，異常放電的過程中起著非常重要的作用。GABA可以通過作用于GABAAR而抑制Glu的釋放［3］，抑制癲癇發作。本次研究結果顯示，抗癇靈能明顯增強戊四氮誘導癲癇大鼠腦內海馬中GABAAR表達，與模型組比較差別有統計學意義。戊四氮致癇模型是一種理想的全身強直-陣攣發作動物模型，針灸可抑制癲癇放電，改善異常腦電圖，起到抗癲癇發作的功效。針刺治療增高腦內GABA蛋白含量［4］，增強細胞免疫功能，提高癲癇患者的免疫球蛋白，降低乙酞膽堿(Ach)含量，調整腦內阿片物質釋放，增加腦內單胺類物質，這些都對臨床針刺治療癲癇獲得很好療效提供了重要的科學依據。實驗結果顯示針刺結合抗癇靈治療對中樞神經系統具有較強的抑制作用，能減少大鼠的自由活動數，拮抗戊四氮所致大鼠驚厥，抑制大鼠電驚厥的發生率，不失為治療癲癇的好方法。

［1］ 李忠仁.實驗針灸學［M］.北京：人民衛生出版社，2004

［2］ 郭有昌，關國英.中國針灸治療事典［M］.哈爾濱：黑龍江科學技術出版社，1992：227

［3］ Martina EV，Uta R，Peter M，et al.Penty enetetra zole(PTZ)-induced c-fos expression in the hippocampus of kinedled rats in suppressed by concomitant treatment with Naoxone［J］.Brain Res，1998，792(3)：299-308

［4］ Seyed M，Mirsattari.EEG Monitoring during Funetional MRI in Animal Models［J］.Epilepsia，2007，48(S4)：37-46