頭穴叢刺法對腦缺血再灌注大鼠腦組織AQP4表達的影響*

劉婷婷，朱文增，金 弘，黃日龍

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040;2.中國中醫科學院廣安門醫院，北京100053; 3.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱150040;4.安徽省中醫院，安徽合肥230031)

頭穴叢刺法對腦缺血再灌注大鼠腦組織AQP4表達的影響*

劉婷婷1，朱文增2△，金 弘3，黃日龍4

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040;2.中國中醫科學院廣安門醫院，北京100053; 3.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱150040;4.安徽省中醫院，安徽合肥230031)

目的:研究頭穴叢刺法對腦缺血再灌注大鼠的腦保護作用機制。方法:采用改良的線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型。將Wistar雄性大鼠，隨機分成3組:假手術組、模型組、頭穴叢刺組。各組隨機分成6 h、1 d、2 d、3 d共5個時間點，采用免疫組織化學技術檢測大鼠腦缺血再灌注后AQP4蛋白表達變化及頭穴叢刺法治療對它們的影響。結果:免疫組化結果顯示與模型組比較，頭穴叢刺組損傷側腦組織AQP4蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。結論:頭穴叢刺法能夠調節AQP4的表達，減輕由于再灌注損傷導致的血腦屏障通透性增強，從而減輕腦水腫，在腦缺血再灌注早期起到挽救和保護受損神經元、改善神經功能的治療作用。

腦缺血再灌注;頭穴叢刺法;腦水腫;水通道蛋白－4

缺血性腦血管病以其高發病率、高致殘率和高死亡率嚴重影響著人們的健康。恢復缺血腦組織的血流灌注是治療腦缺血的前提，但再灌注過程中會繼發多種腦組織損傷。經過多年的研究，針刺在治療腦缺血急性期和后遺癥神經元保護方面取得了重要進展，頭穴叢刺法治療在臨床上取得極好的療效。本研究擬從分子水平探討頭穴叢刺法對腦缺血再灌注損傷后血腦屏障功能恢復和腦水腫的防治機制，證實頭穴叢刺法在改善神經功能、促進神經再生、血腦屏障修復和功能重建等方面的優勢，為臨床上進一步采用頭穴叢刺法治療腦梗死提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性清潔級Wistar大鼠180只，體質量(250± 20)g，鼠齡4～5個月，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供(動物生產許可證編號:黑動字第P00102008)。大鼠自由進食、飲水，同等條件下適應性飼養1周，手術前12 h禁食不禁水。按隨機數字表法將動物隨機分成3組:假手術組、缺血再灌注模型組(以下簡稱模型組)、缺血再灌注后頭穴叢刺治療組(以下簡稱頭針組)。各組隨機分成6 h、1 d、2 d、3 d、5 d共5個時間點，每個時間點12只動物。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備

采用改良的Zea Longa法［1，2］制作右側大腦中動脈阻塞(腦缺血)再灌注模型。

栓線制備［3］:把直徑0.234 mm的日本產釣魚用尼龍線(日本漁具株式會社)切割成長約5.0 cm的小線段，將其一端快速閃過火焰燒制成光滑球形，選用表面光滑、斷面平直及球體直徑約為0.25 mm的線栓，在離球端3 cm處標記，75%酒精清潔處理，浸泡于125 mg/dl肝素生理鹽水中，置于4℃冰箱內備用。

模型制備過程:10%水合氯醛35 mg/kg腹腔麻醉，頸部正中切口，自胸骨角到距離鼠下唇1.0 cm處，剝離暴露右側頸總動脈1～1.5 cm，近心端絲線結扎，并結扎右側頸外動脈。頸總動脈切口，栓線插入18～20 mm，將栓線經頸內動脈送至大腦中動脈起始處，逐層縫合。腦缺血2 h后，輕輕回撤栓線，實現腦缺血再灌注。術中及術后維持動物肛溫在(37±1)℃，術后分籠飼養，自由飲食飲水。

1.2.2 取穴及針刺方法

參照《實驗針灸學》［4］取大鼠的百會穴和百會穴左右旁開2 mm共3個穴位。

假手術組:手術時把尼龍栓線僅插入頸總動脈6 mm左右而不入顱;術后不給予任何治療。

模型組:造模后，不給予任何治療。

頭針組:待動物評分后開始給予頭穴叢刺治療，每日針刺1次，用0.35 mm×25 mm毫針從后向前平刺大約6～8 mm，每次留針30 min，每15 min捻針1次，頻率為200轉/min左右，每次持續捻轉3 min。

1.3 觀察項目及方法

1.3.1 動物神經系統體征的觀察與評分標準

參照Zea Longa的5級評分標準［1］，所有動物再灌注完成后6 h，進行第1次神經功能缺損評分，以后分別于再灌注后1 d、2 d、3 d、5 d時進行神經功能評分。0分:無神經缺損癥狀，活動正常;1分:不能完全伸展左側前肢，輕度局灶性神經功能缺失;2分:行走時身體向左側轉圈，中度局灶性神經功能缺失;3分:行走時身體向左側傾倒，重度局灶性神經功能缺失;4分:不能自發行走，意識水平喪失。

造模后對其進行初選，保留神經功能評分在1～3分的大鼠。造模及針刺過程中死亡的大鼠予以剔除，按隨機數字表補入。密切觀察造模大鼠的各項體征，詳細記錄。

1.3.2 免疫組化法檢測AQP4蛋白的表達

AQP4在星形膠質細胞及血管周圍呈棕黃色為陽性表達。免疫組化染色切片圖像結果分析方法:采用Motic Med6.0圖像分析系統，每組選6張切片，利用顯微攝像系統，每張切片在400倍下隨機選取缺血區5個非重疊視野，AQP4計算陽性顯色的面積百分比，取其平均值進行統計學分析。

1.4 統計方法

2 結果

2.1 實驗各組大鼠神經功能缺損評分比較

見表1。模型組在2 d時神經功能缺損評分顯著高于6 h、1 d(P=0.001，0.041＜0.05)，隨后開始下降，在5 d時明顯優于2 d評分，具有顯著性差異(P= 0.001＜0.05)，但與3 d、6 h差異不顯著。可見在缺血再灌注6 h～2 d，神經功能缺損有所加重，隨著缺血時間的延長，模型組大鼠神經功能缺損在一定程度上存在著自發性恢復的趨勢。頭針組在3 d時神經功能缺損評分明顯減少，與2 d、1 d時比較，具有顯著性差異(P=0.001，0.047＜0.05)，但與6 h比較，無顯著性差異(P=0.370＞0.05)，至5 d時評分減少程度更明顯，分別優于6 h、1 d、2 d、3 d(P=0.003，0.001，0.001，0.001＜0.05)。

與假手術組比較，大鼠腦缺血再灌注后不同時間點模型組、頭針組均出現不同程度的神經功能缺損，兩兩比較具有顯著性差異(P＜0.05);頭針組在術后6 h、1 d、2 d與模型組比較無顯著性差異(P=0.294，0.533，0.264＞0.05)，3 d、5 d時均可見神經功能缺損評分減少，頭針組明顯優于模型組，具有顯著性差異(P=0.003，0.001＜0.05)。說明頭穴叢刺法能夠促進腦缺血大鼠神經功能的恢復，減輕神經功能缺損癥狀。

2.2 頭穴叢刺法對腦缺血再灌注大鼠缺血側腦組織AQP4表達的影響

見表2。假手術組大鼠AQP4主要在皮層、皮層下白質及紋狀體區的毛細血管壁、膠質細胞的胞膜表達，而在神經元則未見表達。模型組AQP4表達隨時間的推移而發生一定變化，在1 d時降至最低，隨后逐漸回升，個別大鼠在海馬錐體細胞層出現陽性表達。頭針組也可見AQP4表達，與假手術組較為接近。

模型組在6 h缺血側腦組織中AQP4表達有所下降，1 d時缺血側腦組織中AQP4表達降至最低，與6 h時比較，具有顯著性差異(P=0.001＜0.05);從2 d開始逐漸恢復，3 d時腦組織中AQP4表達明顯高于1 d (P=0.001＜0.05);5 d時腦組織中AQP4表達繼續回升，接近正常數值，但顯著高于1 d(P=0.001＜0.05)，且與3 d相比，有顯著性差異(P=0.001＜0.05)。

與假手術組比較，大鼠腦缺血再灌注后6 h、1 d、2 d、3 d模型組AQP4表達均出現不同程度的改變，兩兩比較具有顯著性差異(P＜0.05);頭針組在再灌注后6 h與模型組比較無顯著性差異(P=0.275＞0.05)，1 d、2 d、3 d、5 d時頭針組AQP4表達雖有明顯回升，但1 d、2 d、3 d、5 d時AQP4表達明顯低于同時間點模型組，具有顯著性差異(P=0.035，0.049，0.007，0.001＜0.05)。

表1 實驗各組大鼠神經功能缺損評分 (±s)

表1 實驗各組大鼠神經功能缺損評分 (±s)

注:與假手術組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。

6 h 1 d 2 d 3 d 5 d假手術組組別 例數120 0 0 0 0模型組 12 1.83±0.49*2.29±0.39*2.67±0.33*2.25±0.40*1.96±0.54*頭針組 12 1.67±0.44*2.21±0.40*2.54±0.33*1.83±0.39＊△1.08±0.63＊▲

表2 頭穴叢刺法對腦缺血再灌注大鼠缺血側腦組織AQP4表達的影響 (%，±s)

表2 頭穴叢刺法對腦缺血再灌注大鼠缺血側腦組織AQP4表達的影響 (%，±s)

注:與假手術組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。

6 h 1 d 2 d 3 d 5 d假手術組 6 7.43±0.54 7.53±0.44 7.55±0.59 7.57±0.62 7.組別 n 51±0.65模型組 6 5.56±0.56*3.89±0.55*4.33±0.42*5.94±0.63*7.35±0.53頭針組 6 5.40±0.54*3.61±0.53＊△4.08±0.40＊△5.53±0.49＊▲5.71±0.47＊▲

3 討論

近年來研究發現，水通道蛋白(aquaporin，AQP)家族中的AQP4可介導水跨膜的雙向運動，參與血漿滲透壓的調節、血腦屏障的發育和功能維系，并兼有細胞外滲透壓感受器的功能，對維持腦內水平衡至關重要，與腦水腫有著密切的關系［5～6］。

本研究發現的AQP4水平或活性主動降低正是機體從微觀上對腦水腫和血腦屏障損傷的一種保護性反應。其可能的作用機制是:缺血再灌注損傷后，細胞間隙中增高的K+、H+以及以谷氨酰胺為首的一系列興奮性氨基酸濃度上升，由此刺激膠質細胞啟動激活細胞內信號傳導系統［7］，并導致蛋白激酶 C活性升高［8］，激活的蛋白激酶C對AQP4進行磷酸化反應，AQP4經磷酸化后其生物活性喪失［9～11］，從而在一定程度上減少經由破壞的血腦屏障進入腦組織細胞間隙以及經膠質細胞膜進入細胞內的水分子的量，從而達到減緩腦水腫的目的。但是當局部區域的各種有害物質逐漸增多，細胞外間隙中的H+、Na+、K+、Cl－、興奮性氨基酸濃度繼續升高到一定水平時，這時膠質細胞將對此作出另一方向的調節以緩沖正在急劇惡化的細胞外液環境，這時的膠質細胞在增加清除K+的同時，將通過提高包括AQP4在內的多種AQPs表達水平和活性［12］，以增加遭受破壞的血腦屏障對水分子的通透，增加細胞外間隙水含量，從而降低細胞外液中有害物質的濃度，達到進一步保護神經元功能的目的。已有證據［13］提示腦組織中AQP4可能調節腦脊液的形成及細胞外液的容積的變化。本實驗結果進一步證實AQP4與腦缺血性腦水腫的形成有關。與近年來國內外的動物實驗及臨床觀察的研究結果一致［14～15］。

本課題是針灸專家于致順教授頭穴叢刺系統研究的總結與深化，其可能的作用機制是:在頭部相應治療區進行“叢式”針刺，間斷行針，針刺每一穴位后，在所針刺穴位處產生了一定的生物磁場，多個場相互作用并增強場的效應，通過傳導系統(經絡、神經)作用于人體相應的部位，增強對身體相應部位的作用。這種生物磁場還可以直接的穿透高阻抗的顱骨作用于大腦皮層，改善腦血流，促進水液循環及物質代謝，從而利于水腫的消除，并能產生相應的神經沖動，改善神經沖動的傳導，促進神經恢復。這樣的針刺方法從針刺部位上來說，使對頭部的刺激由原來點狀刺激或線狀刺激擴展到了面狀刺激，增加了針刺的刺激面積［16～17］，同時也增加了刺激量，從而體現出頭穴叢刺法相比于其它頭針療法的治療優勢。

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The Effect of Cluster Acupuncture on Scalp Points on AQP4Expression in Cerebral Ischemica Reperfusion Rats

LIU Ting－ting1，ZHU Wen－zeng2△，JIN Hong3，HUANG Ri－long4
(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2.Guang＇anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China; 3.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 4.Anhui Provincial Hospital of Chinese Medicine，Hefei 230031，China)

Objective:To explore cerebral protection mechanism of cluster acupuncture on scalp points (CASP)in cerebral ischemia reperfusion(CIR)rats.Methods:Focal cerebral ischemia was induced by intraluminal middle cerebral artery occlusion(MCAO)method using a monofilament thread in rats.Male Wistar rats were divided randomly into three groups:sham group、model group、and CASP group;each group was separated into 6 h，l d，2 d，3 d，5 d after reperfusion as subgroup for investigation.The expression of AQP4protein in CIR rats were measured by immunohistochemical method and the influence of the expression by CASP was observed.Results:Immunohistochemistry results indicated that compared with model group，the expression of AQP4has been significantly increased in CASP group(P＜0.05，P＜0.01).Conclusion:CASP method can regulate AQP4expression to reduce BBB permeability to prevent cerebral edema，through reducing cerebral edema，CASP method can save and protect damaged neurons，improve nervous function at early stage of CIR.

Cerebral ischemia reperfusion;Cluster acupuncture on scalp points(CASP);Cerebral edema; AQP4

R246.1

A

1005－0779(2012)008－0055－03

2012－01－15

黑龍江省自然科學基金項目，編號:2006D－61。

劉婷婷(1979－)，女，講師，主要研究方向:針刺治療神經系統疾病的研究。

△通訊作者:朱文增(1971－)，男，副主任醫師，主要研究方向:頭針防治中風和中醫臨床評價。