結核分枝桿菌Ag85A DNA疫苗抗結核作用的研究

梁艷 吳雪瓊 張俊仙 白雪娟 陽幼榮 李寧 余琦 李忠明 王蘭 史迎昌

結核病是一種慢性呼吸道傳染病，合理、規(guī)律的化療一般在1～2個月內即可殺死病灶內絕大多數Mtb，但仍有少量菌殘留，尤其是寄生于巨噬細胞內的Mtb不易被殺死，需繼續(xù)治療3～4個月，甚至更長時間。由于耐多藥結核病的流行、化療藥物的不良反應，以及人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的感染、免疫抑制劑的使用和老年性結核病等原因引起的機體免疫功能低下，使難治性結核病增多，抗結核治療面臨巨大的挑戰(zhàn)，尤其是耐多藥結核病（MDR－TB）、廣泛耐藥結核病（XDR－TB）面臨無藥可治的困難局面。因此，研制新的抗結核制劑及新的有效、價廉的治療方案勢在必行。

抗結核免疫主要是細胞介導的免疫反應，體液免疫是否起作用尚有爭議，機體的免疫狀態(tài)與結核病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸密切相關。治療性疫苗的應用對象與預防性疫苗不同，前者用于Mtb感染者或結核病患者，而后者用于正常人群。免疫治療可以通過調節(jié)或選擇性地誘導結核病患者免疫系統蘊藏的潛力，來達到治療疾病的目的。在抗結核化療的基礎上聯合免疫治療有可能縮短療程，實現“超短程化療”。近年來通過免疫調節(jié)輔助治療結核病成為研究的熱點之一，免疫治療制劑的研究與開發(fā)成為一個十分重要的研究方向。死疫苗（如微卡菌苗和烏體林斯）只能誘導體液免疫和Th1型細胞免疫應答，不能誘導特異性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）應答；而DNA疫苗在細胞內生成內生性抗原，不僅能誘導體液免疫和Th1型細胞免疫應答，還能誘導特異性CTL應答，這對于殺滅巨噬細胞內寄生的分枝桿菌更有意義。因此，解放軍第三〇九醫(yī)院全軍結核病研究所和上海海規(guī)生物科技有限公司聯合研制了Mtb Ag85A DNA疫苗，并在國內外首先將其用于結核病治療研究［1］。筆者簡要地概述本課題組 Mtb Ag85A DNA疫苗抗結核作用的研究情況。

一、免疫原性的研究

1.小鼠血清中抗Ag85A蛋白抗體水平：小鼠免疫前、第1次至第3次免疫后10 d取血清，通過ELISA方法檢測各組抗Ag85A抗體，以各組小鼠免疫前抗體水平為對照，計算生理鹽水組、p VAX1載體組、微卡菌苗組和Ag85A DNA疫苗組小鼠第1次至第3次免疫后抗體升高水平。

生理鹽水組在第1次至第3次免疫后，抗Ag85A抗體水平均無顯著增高（P＞0.05）。p VAX1載體組在第1次至第3次免疫后，抗Ag85A抗體均極顯著增高（P＜0.01），于第2次免疫后達到高峰，證明p VAX1載體具有一定的非特異免疫增強作用。微卡菌苗組在第1次免疫后，抗Ag85A抗體極顯著增高（P＜0.01）；第2次、第3次免疫后，抗Ag85A抗體也顯著增高（P＜0.05）；于第3次免疫后達到高峰，表明微卡菌苗具有非特異免疫增強作用。Ag85A DNA疫苗組在第1次至第3次免疫后，抗Ag85A抗體均極顯著增高（P＜0.01），于第2次免疫后達到高峰，抗體升高水平均顯著高于對照組，證明Ag85A DNA疫苗可刺激小鼠特異的體液免疫功能。

2.小鼠第3次免疫后分泌γ干擾素的T淋巴細胞斑點數［2］：小鼠第3次免疫后14 d殺鼠取血抗凝，通過酶聯免疫斑點實驗（enzyme－linked immunospot assay，ELISPOT）方法檢測各組分泌γ干擾素的T淋巴細胞斑點數，以各組小鼠空白對照孔為對照，計算各組小鼠檢測孔的細胞斑點數。

生理鹽水組未見Ag85A特異的分泌γ干擾素的T淋巴細胞；p VAX1載體組和微卡菌苗組均可見少量Ag85A特異的分泌γ干擾素的T淋巴細胞；而Ag85A DNA疫苗組可見大量Ag85A特異的分泌γ干擾素的T淋巴細胞。結果表明Ag85A DNA疫苗顯著增強了小鼠特異的細胞免疫功能。

3.小鼠脾淋巴細胞分泌γ干擾素和白細胞介素－4的水平［2］：小鼠第3次免疫后14 d殺死小鼠，取脾臟，研磨后分離脾淋巴細胞，經抗原刺激后，通過ELISA方法檢測各組分泌的γ干擾素和白細胞介素－4，計算各組小鼠檢測孔的細胞因子分泌量。

Ag85A DNA疫苗組小鼠脾淋巴細胞分泌γ干擾素的水平明顯高于生理鹽水組、p VAX1載體組和微卡菌苗組，而分泌白介素－4的水平明顯減少。結果表明Ag85A DNA疫苗主要刺激Th1型的免疫反應。

4.Mtb MPT64、ESAT6、Ag85A和 Ag85B 4種 DNA疫苗免疫原性的比較：（1）雌性BALB/c小鼠結核感染8周、第1次至第4次免疫治療后2周及免疫治療5個月時，通過ELISA方法檢測各組抗結核分枝桿菌分泌蛋白64（Mycobacterium tuberculosis secreted protein 64，MPT64）或早期分泌抗原靶6 （early secretory antigenic target 6，ESAT6）或Ag85A抗體。通過動態(tài)觀察DNA疫苗組小鼠抗特異性抗原抗體的變化，發(fā)現一般在第2次免疫治療后，抗體才開始升高，第3、4次達到高峰，停止治療3個月后抗體已開始下降或明顯下降，說明 MPT64、ESAT6、Ag85A DNA疫苗肌內注射后確實能在機體內表達蛋白，但DNA疫苗激活B細胞的反應較滯后，可能是因為抗體的產生有賴于完整抗原被B細胞識別。其中MPT64 DNA疫苗誘導的抗體水平最高，其次是ESAT6 DNA疫苗，Ag85A DNA疫苗誘導的抗體水平較低，可能是因為ESAT6和Ag85A是T細胞抗原，主要刺激T淋巴細胞，而MPT64既是T細胞又是B細胞抗原；也可能是MPT64在體內表達量較高，而其他2種質粒DNA表達量較低所致。上述3種抗體均以IgG2a和IgG1為主，IgG2a均顯著高于IgG1，說明主要誘導Th1型免疫功能。這3種質粒DNA都能較好地刺激機體的細胞免疫功能，使脾淋巴細胞轉化率顯著增高［3］。（2）通過ELISA方法檢測雌性C57BL/6小鼠第3次DNA免疫后第12 d血清中抗MPT64、ESAT6、Ag85A 和 Ag85B抗 體IgG 及 其 亞 型IgG1、IgG2a和IgG2b。結果顯示 MPT64、ESAT6、Ag85A和Ag85B DNA免疫后均可誘導產生特異性抗體。但MPT64或ESAT6與IL－12或γ干擾素質粒DNA共同免疫小鼠后，抗MPT64或ESAT6抗體水平無顯著升高，與對照組相比較差異無統計學意義，說明DNA疫苗與細胞因子共同免疫后，細胞因子可減少小鼠對DNA疫苗的抗原特異性抗體反應，主要誘導細胞免疫功能［4］。此外，上述4種抗體亞型IgG2a均無顯著升高，IgG2b均顯著高于IgG1，表明C57BL/6小鼠主要是IgG2b升高為主，與BALB/C小鼠主要以IgG2a升高為主不同。但無論是IgG2a還是IgG2b占優(yōu)勢都說明是誘導Th1型免疫功能為主，而結核的保護性免疫恰恰與一個強的Th1型T細胞反應的建立有關。

鑒于Ag85A DNA疫苗以誘導Th1型免疫反應為主；免疫治療2個月時，肺菌落數減少較其他DNA疫苗顯著，因此，選擇Ag85A DNA疫苗治療小鼠結核病模型1～2個月進一步研究。

二、Mtb Ag85A DNA疫苗治療抗結核藥物敏感的結核病的療效

用Mtb H37Rv通過尾靜脈注射50只BALB/c小鼠，分別用生理鹽水、p VAX1載體、利福平（RFP）、草分枝桿菌菌苗和Ag85A DNA疫苗治療。免疫治療3次后，與生理鹽水對照組比較，p VAX1載體組肺菌落數顯著高于生理鹽水組（P＜0.05），肝臟菌落數差異無統計學意義（P＞0.05）；RFP治療組、草分枝桿菌菌苗治療組和Ag85A DNA疫苗治療組的肺和肝臟菌落數均顯著減少（P＜0.01）；RFP組肺和肝臟菌落數均比草分枝桿菌菌苗組和Ag85A DNA疫苗組顯著減少（P＜0.001）；草分枝桿菌菌苗組和 Ag85A DNA疫苗組的肺和肝臟菌落數差異無統計學意義。

免疫治療5次后，與生理鹽水對照組比較，p VAX1載體組肺和肝臟菌落數差異無統計學意義（P＞0.05）；RFP治療組、草分枝桿菌菌苗治療組和Ag85A DNA疫苗治療組的肺和肝臟菌落數均非常顯著地減少（P＜0.001或P＜0.01）；RFP組肺和肝臟菌落數均比草分枝桿菌菌苗組和Ag85A DNA疫苗組顯著減少（P＜0.001）；草分枝桿菌菌苗組和Ag85A DNA疫苗組的肺和肝臟菌落數差異無統計學意義。

從小鼠肺、肝菌落計數來看，與對照組相比，各治療組均有一定的治療作用，免疫5次和免疫3次，Ag85A DNA疫苗的治療效果相似，但免疫5次的效果較3次時明顯；Ag85A DNA疫苗的免疫治療效果與草分枝桿菌菌苗相當。

三、Mtb Ag85A DNA疫苗聯合化學藥物治療耐多藥結核病的療效研究

DNA疫苗每隔2周免疫1次，共免疫5次。

1.第一次研究：（1）肺組織病理學檢查［5］：肺組織用10%的多聚甲醛固定后包埋在石蠟中切片。組織切片用蘇木精和曙紅試劑染色，在光學顯微鏡下觀察分析結果。生理鹽水組、p VAX1載體治療組肺組織病變廣泛，未見或少見增殖性結節(jié)；RFP治療組、RFP加Ag85A DNA疫苗治療組、Ag85A DNA疫苗治療組、RFP加 Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組、Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組、微卡菌苗治療組肺組織病變均較輕，病變范圍局限，可見較多的結核結節(jié)，主要呈增殖性改變。（2）肺、脾懸液涂片抗酸染色［6］：各對照組和RFP對照組肺Mtb較粗大，而各疫苗治療組肺部分 Mtb變細而短。（3）肺和脾菌落計數［5］：各疫苗治療組肺脾菌落計數均比對照組和RFP治療組減少2～5倍。與生理鹽水對照組比較，p VAX1載體組和RFP治療組的肺和脾臟菌落數差異無統計學意義（P＞0.05）；微卡菌苗治療組、HSP65 DNA疫苗、Ag85A DNA疫苗和Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組的肺和肝臟菌落數均顯著減少（P＜0.05或P＜0.001）；Ag85A DNA疫苗單獨治療或聯合RFP治療小鼠耐多藥結核病模型的肺和脾臟菌落數均少于Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組和HSP65 DNA疫苗治療組，但差異無統計學意義（P值均＞0.05）。

2.第二次研究［2］：（1）各組小鼠死亡情況：p VAXI載體組、RFP治療組、微卡菌苗治療組、Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組、RFP加Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組小鼠死亡率分別是10%、10%、10%、100%、20%，吡嗪酰胺（PZA）治療組、Ag85A DNA疫苗治療組、RFP加Ag85A DNA疫苗治療組、PZA加Ag85A DNA疫苗治療組和PZA加Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組小鼠均存活。（2）肺臟組織病理改變：治療結束后4周，p VAX1載體組和RFP組肺組織病變嚴重、廣泛，實變，肺泡壁重度腫脹、增厚，正常肺泡結構消失，可見大量的淋巴細胞浸潤。PZA組小鼠肺組織病變比p VAX1載體組和RFP組略輕，肺泡壁中度和重度增厚，1/5區(qū)域可見正常的肺泡結構，病變區(qū)域可見多核巨細胞、泡沫樣細胞和中等量淋巴細胞。Ag85A DNA疫苗組、Ag85A DNA疫苗聯合RFP組、Ag85A DNA疫苗聯合PZA組小鼠肺組織病變比PZA組輕，病灶局限，1/2區(qū)域可見正常的肺泡結構，肺泡輪廓相對清晰，病變區(qū)域可見多核巨細胞、泡沫樣細胞和少量淋巴細胞。Ag85A/ESAT6嵌合DNA聯合RFP組、Ag85A/ESAT6嵌合DNA聯合PZA組小鼠肺組織病變比PZA組輕，病灶局限，但治療效果不如Ag85A DNA疫苗單獨治療組或聯合藥物治療組。（3）肺、脾活菌計數：與對照組相比，Ag85A DNA疫苗單獨治療或與RFP、PZA聯合治療的肺和脾菌落數分別減少了1.0～1.38 logs。上述2次研究結果顯示，應用HSP65、Ag85A和Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療耐多藥結核病的小鼠，并以微卡菌苗、RFP、PZA、質粒載體和生理鹽水為對照，免疫治療2個月后，RFP單獨治療耐多藥結核病無效，而PZA治療有效，說明成功地建立了小鼠耐多藥結核病模型；與對照組相比，各疫苗治療組均有明顯的療效，尤其是Ag85A DNA疫苗單獨應用或聯合化療的療效明顯強于Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗、HSP65 DNA疫苗和微卡菌苗組，與抑菌藥PZA相當。其機制可能是抗結核藥物雖不能殺滅耐多藥 Mtb，但對該菌具有一定的抑制作用；Ag85A DNA疫苗能調動機體的免疫功能殺滅已被抑制的Mtb，并增強RFP或PZA對耐多藥Mtb的殺菌效力。ESAT 6與Ag85A嵌合構建的DNA疫苗未能增強Ag85A DNA疫苗的治療效果，可能是由于ESAT6是Mtb毒力因子所致，由此可見抗原的選擇至關重要。

總之，結核病是一種細菌性傳染性疾病，從另一個角度來看也是一種細胞免疫疾病，Mtb Ag85A DNA疫苗可誘導小鼠體液免疫和Th1型細胞免疫應答，可減少小鼠組織中的Mtb尤其是耐多藥Mtb的數目，該疫苗與常規(guī)化療聯合不僅可提高機體免疫力，并可有效地殺滅或抑制Mtb，提高化療效果，縮短療程，從而為結核病尤其是耐藥結核病的治療開辟了新途徑。

［1］吳雪瓊，張俊仙，李洪敏，等.結核分枝桿菌Ag85A DNA疫苗免疫治療作用的研究.中國免疫學雜志，2002，18（1）：17－22.

［2］Liang Y，Wu X，Zhang J，et al.Treatment of multi－drug－resistant tuberculosis in mice with DNA vaccines alone or in combination with chemotherapeutic drugs.Scand J Immunol，2011，74（1）：42－46.

［3］吳雪瓊，李洪敏，史迎昌，等.結核分枝桿菌DNA疫苗抗結核作用的研究.中國生物制品學雜志，2002，15（6）：340－345.

［4］吳雪瓊，鄭越，徐燕杰，等.不同劑量結核病DNA疫苗及細胞因子聯合免疫的研究.中國免疫學雜志，2006，22（10）：883－894.

［5］Liang Y，Wu X，Zhang J，et al.The treatment of mice infected with multi－drug－resistant Mycobacterium tuberculosis using DNA vaccines or in combination with rifampin.Vaccine，2008，26（35）：4536－4540.

［6］白雪娟，李寧，余琦，等.DNA疫苗對感染結核分枝桿菌耐藥株小鼠治療效果的病理學評價.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2010，5（1）：74－79.