卡介菌Cp G DNA復合佐劑－02系統（BC－C02）有效性與安全性評價

趙愛華 李鳳祥 寇麗杰 李長貴 喬來艷 王鵬 陳保文 徐苗 都偉欣沈小兵 蘇城 盧錦標 楊蕾 王國治

目前，人用疫苗應用最廣泛、最安全的佐劑為鋁佐劑，鋁佐劑誘導強烈體液免疫反應，對細胞免疫作用則不明顯［1］。近年來新型疫苗研究中采用的重組蛋白抗原或亞單位抗原一般由于相對分子質量小、體內滯留時間短等原因，免疫原性弱，必須與佐劑聯用才有效，但傳統的鋁佐劑由于其本身固有的局限性，尤其針對細胞免疫為主的疫苗，因此人們一直致力于新型佐劑的研究，如乳化劑MF59佐劑、免疫刺激劑CpG佐劑、細胞因子白細胞介素－12（interleukin－12，IL－12）等。鑒于單一佐劑疫苗作用的局限性，聯合作用機制不同的幾種佐劑，發揮疫苗的免疫保護作用，即使用復合佐劑成為疫苗研究的新形式［2－4］，如將遞送系統與免疫刺激型佐劑聯合使用，不同Toll樣受體（Toll－like receptor，TLR）激動劑的聯用等，GSK公司的佐劑系統（adjuvant system，AS）系列即為佐劑聯合使用，其中AS15中的佐劑種類已達4種［5－7］。

卡介菌（BCG）Cp G復合佐劑（combination adjuvants）－02系統（BC－C02）由生物佐劑、無機鹽佐劑及磷酸緩沖體系組成，其中的生物佐劑為從卡介菌中提取的含未甲基化CpG基序含量達到15.75%～24.75%的天然Cp G DNA［8］，相對分子質量范圍在（1950～9750）×103之間，相對分子質量主要集中在6500×103。鋁鹽佐劑為氫氧化鋁或其他無機鹽。由于生物佐劑富含免疫刺激成分Cp G基序，因此將其與鋁鹽及磷酸緩沖體系組成的復合佐劑系統命名為BC－C02，系統可控p H 范圍為6.6～7.4，滲透壓摩爾濃度在215～345 m Osmol/kg之間。

因此，本研究通過相關體內、體外試驗，檢測細胞表面標志、細胞因子水平、抗體水平及疫苗保護效力及過敏毒性等，對復合佐劑系統BC－C02的有效性及安全性進行評價，為復合佐劑系統BC－C02作為一種新型疫苗佐劑候選佐劑的應用提供實驗室研究基礎。

材料和方法

一、材料

1.材料：BC－C02佐劑系統，重組Ag85B蛋白，甲型H1N1流感滅活抗原、BCG疫苗、Mtb H37Rv由中國食品藥品檢定研究院提供。合成Cp G DNACp G7909由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。Ag85B240－260（FQDA YNA AGG HNA VFN FPP NG）多肽由上海強耀生物科技有限公司合成。流感病毒A/California/07/2009株由中國醫學科學院實驗動物研究所提供。

2.主要試劑：γ干擾素（IFN－γ）酶聯免疫斑點檢測（enzyme－linked immunospot assay，ELISPOT）檢測試 劑 盒、IL－12 ELISPOT 檢 測 試 劑 盒 （瑞 典Mabtech公司生產），PerCP/Cy5.5－抗鼠CD19＋、抗鼠TLR－9－FITC、抗鼠F4/80－APC、Per CP－抗鼠I－A/I－E、PE－抗鼠IL－12（美國 Biolegend公司生產），小鼠淋巴細胞分離液，人淋巴細胞分離液（中國達科為公司生產）。

3.實驗動物：無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級 C57BL/6小鼠和 BALB/C 小鼠，雌性，6～8周；SPF級豚鼠，250～350 g/只，同性，均由中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心提供。

二、動物分組及免疫

甲型H1N1疫苗免疫：BALB/C小鼠分為7組，每組20只，分別為磷酸鹽緩沖液（PBS）組、H1N1低劑量組、H1N1低劑量＋CpG DNA組、H1N1中劑量組、H1N1中劑量＋Cp G DNA組、H1N1高劑量組、H1N1高劑量＋CpG DNA 組；200μl/只動物，頭背部皮下免疫1次；分別于接種后第5、7、14、28天采靜脈血，分離血清，待測抗體水平及抗體亞類；H1N1抗原低、中、高劑量分別為0.2μg/只、1.0μg/只、5.0μg/只。

結核重組Ag85B疫苗免疫：C57BL/6小鼠分為6組，每組4只，分別為PBS組、Ag85B組、Ag85B＋Al組、Ag85B＋Cp G DNA組、Ag85B＋BC－C02組及皮內注射用BCG組。分別于0、14、28 d頭背部皮下免疫3次，100μl/只，劑量為Ag85B抗原5μg，BCG劑量為0.01 mg。

三、方法

1.小鼠脾單個核細胞、小鼠腹腔巨噬細胞、人外周血單個核細胞制備：小鼠淋巴細胞分離液制備脾單個核細胞，小鼠腹腔注射1 ml 4%可溶性淀粉肉湯，3 d后收集腹腔滲出巨噬細胞，人淋巴細胞分離液制備健康人外周血單個核細胞。收集的細胞以5%胎牛血清（FBS）－1640完全培養基重懸，根據需要調整細胞濃度。

2.流式細胞檢測：細胞體外經Cp G DNA刺激后，使用胞外抗鼠CD19＋－Per CP/Cy5.5，抗鼠F4/80－APC、抗鼠I－A/I－E－PerCP對B細胞及巨噬細胞表面分子進行染色。使用抗鼠 CD19＋－Per CP/Cy5.5，抗鼠TLR－9－FITC，對B細胞內TLR－9表達進行檢測，使用 抗鼠F4/80－APC染色，抗鼠TLR－9－FITC，抗鼠IL－12－PE 對巨噬細胞內 TLR－9、IL－12表達進行檢測。流式細胞儀Guava esay cyte 8HT及分析軟件為美國Millipore公司產品。

3.ELISPOT檢測分泌IL－12的細胞數：健康人外周血單個核細胞加入到檢測IL－12的ELISPOT細胞培養板中，體外經Cp G DNA刺激40 h后，按ELISPOT試劑盒說明書操作，檢測分泌IL－12細胞數，ELISPOT儀為美國Cellular Technology公司產品。

4.甲型H1N1流感病毒血凝抑制（HI）抗體及抗體亞類檢測［9］：取50μl滅活血清，從1∶10開始進行2倍系列稀釋，以血凝抑制法檢測血清中HI抗體滴度，HI抗體滴度≥40認為血清陽轉。ELISA法檢測血清中抗原特異性IgG1、IgG2a水平。抗體滴度以A450值高于陰性對照血清2.1倍的最高血清稀釋倍數表示。

5.H1N1疫苗保護力評價：BALB/C小鼠免疫后18 d，以 流感病毒A/California/07/2009株50μl（106TCID50）攻擊動物，觀察14 d，記錄小鼠存活情況，計算動物的存活天數及存活率。

6.Ag85B特異性IFN－γ分泌細胞數檢測：制備免疫后小鼠脾臟制備脾淋巴細胞懸液，調整細胞濃度另加Ag85B240－260多肽和重組Ag85B蛋白，體外刺激40 h后，按ELISPOT試劑盒說明書操作，檢測抗原特異性IFN－γ分泌細胞數（SFC）。

7.Ag85B復合佐劑結核疫苗保護力評價：對潛伏感染Mtb H37Rv的豚鼠，分別給予Ag85B復合佐劑疫苗治療，以生理鹽水（NS）作為對照，治療結束后觀察動物肝、脾、肺病變情況，比較陰轉率及臟器病變指數。

8.過敏毒性檢測：小鼠、豚鼠腹腔給予佐劑，檢測小鼠Ig E水平及豚鼠全身超敏反應情況，對豚鼠全身超敏反應結果觀察和判斷。各組在被攻擊后直至被攻擊后1 h內，密切觀察豚鼠有無抓鼻、豎毛、呼吸困難、痙攣、休克甚至死亡等超敏癥狀，并根據反應情況分級（0級：無明顯反應；1級：只有輕微抓鼻、顫抖或豎毛；2級：有幾次咳嗽，有抓鼻、顫抖或豎毛；3級：多次或連續的咳嗽，伴有呼吸困難或痙攣、抽搐等；4級：痙攣、抽搐、大小便失禁、休克、死亡）。

9.數據分析：實驗結果的統計學分析均采用Minitab 15.0統計軟件處理，兩組間的比較采用成組t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.Cp G DNA刺激B細胞增殖，提高B細胞內TLR－9表達：Cp G DNA與脾細胞體外共培養，流式細胞儀檢測CD19＋B細胞比例及CD19＋TLR－9＋B細胞比例，結果見圖1a。由圖1a可見，Cp G DNA組淋巴細胞中CD19＋細胞比例高于培養基對照組（NCS），差異有統計學意義（t＝－4.40，P＜0.05）。同時CD19＋TLR－9＋B細胞比例也顯著高于NCS對照組（見圖1b），差異有統計學意義（t＝－5.92，P＜0.05）。說明天然CpG DNA能直接刺激B細胞增殖，并提高B細胞內TLR－9的表達，和Cp G 7909的作用類似。

2.Cp G DNA上調巨噬細胞主要組織相容性復合體（MHC）－Ⅱ類分子，提高巨噬細胞內IL－12、TLR－9表達：Cp G DNA與巨噬細胞體外共培養，流式細胞儀檢測巨噬細胞表面MHC－Ⅱ類分子及細胞內IL－12與TLR－9的表達情況見圖1c。由圖1c可見，Cp G DNA組F4/80＋I－A/I－E＋雙陽性細胞比例高于NCS對照組，差異有統計學意義（t＝－4.32，P＜0.05），說明Cp G DNA能上調巨噬細胞表面MHC－Ⅱ分子表達。CpG DNA 組F4/80＋TLR－9＋雙陽性細胞比例高于NCS對照組（圖1d），差異有統計學意義（t＝－6.59，P＜0.05），說明Cp G DNA能提高巨噬細胞內TLR－9表達。F4/80＋IL－12＋雙陽性細胞比例高于NCS對照組（圖1e），差異有統計學意義（t＝5.88，P＜0.05），說明Cp G DNA能促進巨 噬 細 胞 分 泌 IL－12。CpG DNA 組 F4/80＋TLR－9＋IL－12＋三陽性細胞比例高于 NCS對照組（圖1f），差異有統計學意義（t＝4.80，P＜0.05）。Cp G DNA對巨噬細胞作用與Cp G 7909的作用類似。

3.Cp G DNA促進IL－12的分泌：Cp G DNA 促進人外周血單個核細胞（PBMC）IL－12的分泌（圖1g）。由圖1g可見，PBMC經Cp G DNA刺激后，IL－12斑點形成細胞數量隨CpG DNA濃度升高而增加。低、中、高3個劑量CpG DNA組分泌IL－12的細胞數與NCS比較，差異均有統計學意義，P值均＜0.05（tl＝3.697，tm＝3.124，th＝4.829，tLPS＝5.147）。

4.Cp G DNA對H1N1抗體的影響：Cp G DNA對H1N1 HI抗體影響結果見圖2a、b。由圖2a、b可見，免疫后5 d，復合Cp G DNA低、中、高（l、m、h）3個劑量組均檢測出HI抗體，其中高劑量抗原復合Cp G DNA組動物血清全部陽轉，HI抗體滴度均達到40。免疫后7 d，佐劑組的動物血清全部陽轉，對應的單純抗原組動物未全部陽轉。免疫后14 d，復合佐劑組血清HI抗體滴度均為單純抗原組2～3倍，低劑量抗原復合佐劑組抗體滴度為單純中劑量抗原組（1.0μg）的2倍，接近單純高劑量抗原組（5.0μg）水平。免疫后28 d，Cp G DNA的佐劑效果在中、高劑量組表現較為明顯，主要表現為HI抗體滴度提高。Cp G DNA對H1N1抗體亞類影響結果見圖2c，由圖2c可見，免疫后28 d，低、中、高3個抗原劑量組復合CpG DNA后，抗原特異性IgG1水平與單純抗原組差異不大，差異均無統計學意義（t低＝0.00，t中＝0.87，t高＝1.00，P 值均＞0.05），而抗原特異性IgG2a水平均高于單純抗原組，其中低、高劑量組差異有統計學意義（t低＝－2.82，t高＝－4.59，P值均＜0.05）。

5.Cp G DNA提高H1N1疫苗保護效力：Cp G DNA對H1N1疫苗保護效力的影響結果見圖2d。由圖2d可見，與PBS對照組比較，低劑量抗原組經病毒攻擊后，動物存活率提高了20%，存活時間延長了1.9 d。低劑量抗原復合CpG DNA組較PBS組存活率提高了60%，存活時間延長了5.0 d，比單純抗原組存活率提高了40%，存活時間延長了3.1 d。而高劑量組及高劑量復合Cp G DNA組動物存活率為100%。低量抗原組動物存活率及存活時間較高量抗原組分別低50%及縮短3.9 d，而復合Cp G DNA的低量抗原組存活率較高量抗原組的僅低10%，存活時間僅短0.8 d。說明Cp G DNA提高了H1N1疫苗的保護效力。

圖1 CpG DNA對淋巴細胞的免疫刺激作用

圖2 CpG DNA對H1NI疫苗的免疫佐劑作用

6.BC－C02提高分泌抗原特異性IFN－γ 細胞數：通過檢測分泌抗原特異性IFN－γ細胞數來評價疫苗誘導細胞免疫的能力，結果見圖3a。結果分別為致敏細胞體外經合成多肽Ag85B240－260，重組蛋白Ag85B刺激結果，由圖3a可見，無論是合成多肽Ag85B240－260，或是蛋白 Ag85B刺激，只有以 BC－C02為佐劑的疫苗組與BCG有相似的免疫結果，顯著提高了分泌抗原特異性IFN－γ細胞數量（多肽刺激Ag＋BC－C02組與 Ag組比較，t＝－6.37，P＜0.05；蛋白刺激Ag＋BC－C02組與Ag組比較，t＝－3.49，P＜0.05），而且BC－C02為佐劑的疫苗組細胞數量高于BCG組，但兩者之間差異無統計學意義（多肽刺激組 Ag＋ BC－C02與 BCG組比較，t＝－1.36，P＞0.05，抗原刺激組 Ag＋ BC－C02與BCG組比較，t＝0.7，P＞0.05）。

圖3 復合佐劑BC－C02免疫佐劑作用

7.Ag85B－BC－C02結核疫苗保護力評價結果：Mtb潛伏感染動物經疫苗治療后，臟器結核病變完全轉陰的動物達到30%（對照組動物100%病變），而且病變指數＜30的動物達到60%～70%，平均病變指數與NS組比較均降低（圖3b），中劑量疫苗組和NS對照組比較差異有統計學意義（t＝2.20，P＜0.05），低、高劑量疫苗組與對照組比較，平均病變指數降低，但差異無統計學意義，P值分別為0.077及0.061（t低＝1.88，t高＝2.01）。

8.免疫毒理結果：Cp G DNA對小鼠的免疫毒理結果見圖4。由圖4可見，Cp G 200μg腹腔給予小鼠，隔日1次，共3次，免疫后18 d，檢測血清中IgE水平，Cp G DNA組與陰性對照NS組比較，差異無統計學意義（t＝－1.46，P＞0.05），陽性對照組（OVA鋁復合物）血清中IgE水平均顯著高于陰性對照組，差異有統計學意義（t＝－8.19，P＜0.001）。同時陽性對照組動物給予Cp G DNA治療后，其血清中IgE水平較陽性對照組顯著性降低（t＝－6.58，P＜0.001），說明Cp G DNA 的治療不會引起過敏毒性，并且可以逆轉超敏反應程度。

圖4 CpG DNA致敏動物后，不會引起動物血清IgE水平提高

結核復合佐劑疫苗的免疫毒理結果見表1。由表1可見，牛血清白蛋白（BSA）陽性對照組豚鼠在被攻擊后6只動物均出現典型超敏癥狀并死亡；復合疫苗組和陰性對照組豚鼠被攻擊后，均未出現任何異常反應，說明Ag－BC－C02復合疫苗不會引起全身超敏反應。

表1 豚鼠全身過敏反應結果（各組均為6只）

討 論

眾所周知，原核生物DNA由于富含未甲基化Cp G基序而具有免疫刺激功能，為了模擬原核生物DNA免疫刺激功能，人們合成了含未甲基化Cp G基序寡核苷酸小片段（20～30個堿基），即Cp G ODN。Cp G ODN是目前研究較多的新佐劑，既能刺激細胞免疫，也能刺激體液免疫。但由于其片段較小，只模擬了原核生物DNA的部分免疫刺激功能；又由于片段小，在機體內容易降解，為了增加穩定性，一般進行硫代修飾，而非天然堿基的加入，增加了其對機體作用的復雜性。與此同時，對天然Cp G DNA的免疫佐劑作用研究則相對較少。

本研究中的生物佐劑，即為從卡介菌中提取的天然Cp G，前期研究將其作為佐劑用于各種疫苗中，結果顯示生物佐劑安全、有效并且和鋁佐劑有明顯的協同作用［10－15］，而廣為應用的鋁鹽佐劑的安全性及有效性則不言而喻。將這2種安全有效的佐劑，輔以磷酸緩沖液體系，制成一種復合佐劑系統——BC－C02，旨在發揮2種佐劑的協同作用，從而促進疫苗誘導有效的免疫保護反應。

結果顯示：BC－C02中生物佐劑CpG DNA能直接刺激B細胞增殖，提高B細胞內TLR－9表達，上調巨噬細胞表面 MHC－Ⅱ類分子表達，促進TLR－9和IL－12的分泌，其免疫刺激作用與Cp G 7909作用相似。說明生物佐劑Cp G DNA是一種TLR－9激動劑，而B細胞與巨噬細胞又是體內重要的抗原呈遞細胞；Cp G DNA提高B細胞與巨噬細胞內TLR－9表達，說明Cp G DNA靶向抗原呈遞細胞，通過與APC細胞的TLR－9受體識別，而影響APC細胞功能。同時Cp G DNA上調巨噬細胞表面MHC－Ⅱ類分子表達，MHC－Ⅱ類分子主要功能為識別與呈遞外源性抗原肽，說明Cp G DNA可能提高APC細胞的呈遞功能而影響后續的免疫反應。Cp G DNA能夠促進IL－12分泌，而IL－12有促進初始的CD4＋T細胞分化成Th1細胞的功能，同時IL－12也是重要的抗病毒細胞因子之一，并且能增強激活的NK細胞和CD8＋T細胞裂解靶細胞的功能。Cp G DNA不僅能刺激小鼠細胞分泌IL－12，同時也能顯著性刺激人外周血細胞分泌IL－12，說明Cp G DNA對動物和人的免疫刺激作用相似，不存在種屬差異。以上結果表明，BC－C02中生物佐劑為一種TLR－9激動劑，能刺激機體的固有免疫，具有免疫刺激功能。

將BC－C02中生物佐劑Cp G DNA與流感滅活抗原H1N1復合，結果顯示生物佐劑能促進抗體的提前產生，提高抗體尤其是IgG2a的水平，并能提高動物對抗病毒感染能力。該結果表明生物佐劑Cp G DNA本身具有免疫佐劑功能。

鋁鹽通過緩釋抗原起到佐劑作用，Cp G DNA本身固有的免疫刺激及免疫佐劑功能，為其與鋁佐劑的協同作用提供了理論基礎。

將BC－C02應用于重組蛋白Ag85B結核疫苗中的結果顯示，只有復合佐劑疫苗組與BCG組致敏細胞。體外經抗原刺激后，分泌的抗原特異性IFN－γ的細胞數量較多，并且顯著高于抗原及單獨佐劑疫苗組，且BC－C02疫苗組略高于BCG組。BCG是目前預防結核病的惟一疫苗，其通過誘導細胞免疫而預防Mtb感染；BC－C02疫苗組與BCG組有相似的免疫效果，說明BC－C02作為疫苗佐劑，能促進疫苗誘導有效的細胞免疫反應，而鋁鹽佐劑對細胞免疫功能不明顯。因此，復合佐劑是由鋁鹽與Cp G DNA協同作用而發揮作用的。對Mtb潛伏感染的動物進行治療，結果顯示，BC－C02疫苗組動物臟器結核病變的陰轉率提高，臟器病變程度減輕，平均病變指數均低于生理鹽水對照組，說明BC－C02佐劑能提高疫苗的保護效力，而鋁鹽佐劑疫苗對臟器病變程度影響不大［14］。因此，復合佐劑是由鋁鹽與Cp G DNA協同作用而發揮作用的。

由于生物佐劑Cp G DNA本身具有免疫刺激作用，分別對其及BC－C02進行免疫毒理評價，結果顯示生物佐劑Cp G DNA本身及復合佐劑BC－C02均不會導致全身超敏反應，而且CpG DNA有降低超敏反應程度的作用。

總之，本研究介紹的“BC－C02”系統，其2種主要成分均為有效的免疫佐劑，其中生物佐劑Cp G DNA既能刺激細胞免疫，也能刺激體液免疫，對細菌、病毒及寄生蟲類抗原均有免疫佐劑作用［10－15］；試驗研究表明其對動物無毒副作用［16－18］；同時作為卡介菌多糖核酸注射液的成分之一，其安全性也得到了有效的驗證。卡介菌多糖核酸注射液是我國自主研發的免疫調節劑［19］，在我國應用已達約5億人次，未發現嚴重不良反應。而鋁鹽作為目前人用疫苗應用最廣的佐劑，其安全性及有效性則不言而喻。因此，本研究為BC－C02應用于新疫苗研究提供了安全、有效的基礎依據。

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