釋放膜微粒：間充質(zhì)干細(xì)胞治療的新機(jī)制

李志勇 郭子寬 綜述 郭志坤 審校

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSC）是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，具有易于取材和體外擴(kuò)增能力強(qiáng)等特點(diǎn)。此外，MSC免疫原性低，且具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。因此，作為細(xì)胞治療和組織工程的重要種子細(xì)胞，MSC已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。研究表明，MSC植入體內(nèi)后，可分化為成骨和軟骨細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞替代的方式，進(jìn)行骨和軟骨組織的修復(fù)，以治療骨關(guān)節(jié)炎、骨折后骨不連、半月板損失等疾病。此外，MSC也可參與包括血管、心肌、脊髓、腦等其它組織的修復(fù)，用于肢體動(dòng)脈硬化、心肌梗死、脊髓損傷等疾病的治療。鑒于MSC明確的骨、軟骨和脂肪分化能力，且植入這些組織后外源MSC在短時(shí)間內(nèi)死亡，人們有理由相信，MSC修復(fù)上述組織損傷的主要機(jī)制在于細(xì)胞的旁分泌作用。即MSC的分化和/或分泌作用，是治療不同疾病的機(jī)制所在。

例如，MSC能分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子及生長(zhǎng)因子，被認(rèn)為是MSC參與心肌組織修復(fù)的主要因素。然而，利用心肌缺血再灌注模型研究發(fā)現(xiàn)，MSC條件培養(yǎng)基能明顯減少心肌梗死的面積，而當(dāng)用濾膜去除條件培養(yǎng)基中的分子量大于1000 KDa的物質(zhì)后，其對(duì)心肌的保護(hù)作用消失[1]。將分子量1000 KDa以上的物質(zhì)進(jìn)行靜脈輸注，又可恢復(fù)與先前幾乎相當(dāng)?shù)男募”Ｗo(hù)作用。結(jié)果表明，心肌保護(hù)作用似乎不是直接源于分子量通常為十幾個(gè)KDa的因子，而具有磷脂包裹特性的、可與目的細(xì)胞快速結(jié)合的某種細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)，極有可能是MSC發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要成分。這種亞結(jié)構(gòu)就是膜微粒（Micro-particles，MP）[1]。

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，外源MSC進(jìn)入體內(nèi)組織后，在應(yīng)激或低氧低營(yíng)養(yǎng)的條件下，可以通過(guò)出芽的形式產(chǎn)生膜微粒；后者作為一種細(xì)胞死亡或活化信號(hào)，可能承載著移植細(xì)胞修復(fù)其周圍組織的主要責(zé)任。

1 膜微粒的產(chǎn)生機(jī)制

雖然膜微粒表面抗原及胞質(zhì)成分等與其來(lái)源細(xì)胞有很多相似之處，但膜微粒絕不僅僅是其來(lái)源細(xì)胞的“袖珍版”。膜微粒的釋放可能是多因素疊加的結(jié)果。在細(xì)胞激活途徑中，激活誘導(dǎo)物通過(guò)使細(xì)胞內(nèi)的Ca2+聚集，導(dǎo)致轉(zhuǎn)位酶等多種酶效能降低或被抑制，進(jìn)而使磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙胺醇不能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)膜，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜的磷脂雙層結(jié)構(gòu)發(fā)生不對(duì)稱重排，磷脂酰絲氨酸暴露于細(xì)胞膜外側(cè)[2]。Ca2+濃度增加時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白斷裂、重構(gòu)，最終質(zhì)膜出芽并脫落，微粒形成。在凋亡途徑中，膜微粒的形成依賴ROCKⅠ的激活，ROCKⅠ能促進(jìn)肌球蛋白輕鏈的磷酸化并和肌動(dòng)蛋白相互結(jié)合，引起細(xì)胞骨架的重排進(jìn)而形成膜微粒[3]。

2 膜微粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

幾乎所有的真核細(xì)胞，包括干細(xì)胞及前體細(xì)胞在內(nèi)[4－5]，在接受刺激或凋亡過(guò)程中，均會(huì)通過(guò)質(zhì)膜出芽的形式產(chǎn)生膜微粒。在質(zhì)膜出芽過(guò)程中，包裹一定的細(xì)胞質(zhì)，其中富含多種細(xì)胞因子、趨化因子、酶類、生長(zhǎng)因子及信號(hào)蛋白[6]，某些細(xì)胞來(lái)源的膜微粒還含有功能性RNA及微小RNA[7]。這些微粒成分絕不是隨機(jī)包裹進(jìn)來(lái)的，而是為實(shí)現(xiàn)某種生物學(xué)功能，通過(guò)某些未知機(jī)制組裝而成的。膜微粒作為一群細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)，能穩(wěn)定存在于多種體液內(nèi)[8]，體外反復(fù)超速離心或凍融均不影響其形態(tài)大小，但4℃或37℃保存可能導(dǎo)致膜微粒結(jié)構(gòu)降解[9]。膜微粒呈球形結(jié)構(gòu)，直徑約為40～1000 nm，約105 g的離心力作用1 h，完全可以使其沉積于管底。膜微粒的質(zhì)膜富含脂質(zhì)載體、膽固醇、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺和暴露的磷脂酰絲氨酸[10]。雖然不同的細(xì)胞時(shí)相或微環(huán)境能夠影響膜微粒的內(nèi)容物，但MSC來(lái)源的膜微粒擁有一些共同的表面蛋白，如：CD81、CD9、CD63 及 Alix等透膜蛋白[11]。 此外，MSC-MP 還攜帶其母體細(xì)胞特有的黏附分子，如CD29、CD44、CD73等。間充質(zhì)干細(xì)胞在凋亡過(guò)程中，不但釋放凋亡小體，而且可以釋放膜微粒等其他微囊物質(zhì)。

值得注意的是，直至目前，人們尚未對(duì)膜微粒進(jìn)行明確的定義。一般認(rèn)為，膜微粒特點(diǎn)如下：①直徑在40～1000 nm，具有球形結(jié)構(gòu)；②具有細(xì)胞骨架、磷脂雙層結(jié)構(gòu)；③缺乏細(xì)胞核或缺乏合成蛋白的能力；④可以來(lái)源于不同的細(xì)胞，并表達(dá)來(lái)源細(xì)胞的表面特異抗原；⑤發(fā)生在細(xì)胞凋亡早期，高表達(dá)磷脂酰絲氨酸[12]。這些特點(diǎn)與內(nèi)涵體和凋亡小體有很大的區(qū)別。內(nèi)涵體在細(xì)胞受激活時(shí)產(chǎn)生且不具有Annexin V結(jié)合能力。凋亡小體的直徑可高達(dá)4000 nm，發(fā)生在凋亡晚期，具有Annexin V高親和力。

3 膜微粒發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的途徑

膜微粒表面有為數(shù)眾多的膜結(jié)合蛋白、膜錨定受體、黏附分子、細(xì)胞表面特異抗原等，通過(guò)這些細(xì)胞表面分子，膜微粒可以在不同的細(xì)胞之間進(jìn)行信息的傳遞。在形成膜微粒的過(guò)程中，大量的細(xì)胞內(nèi)含物（細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、信號(hào)通道蛋白等）及RNA和微小RNA[7]包被于膜微粒中。大量研究顯示，膜微粒可能主要通過(guò)兩種途徑發(fā)揮作用：第一，由于膜微粒中包含了大量的內(nèi)容物（細(xì)胞因子、RNA及其表面活性脂質(zhì)結(jié)構(gòu)），因此膜微粒通過(guò)與目的細(xì)胞融合或直接釋放其內(nèi)容物，從而激活細(xì)胞，改變細(xì)胞表型，使受體細(xì)胞功能發(fā)生改變[13]；第二，膜微粒可以通過(guò)其表面的分子與其相應(yīng)的抗體結(jié)合從而激活目標(biāo)細(xì)胞。目標(biāo)細(xì)胞一旦被激活，即啟動(dòng)相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，產(chǎn)生應(yīng)答。同時(shí)，膜微粒不只停留存在于起源細(xì)胞的周圍，也可以隨血液循環(huán)遷徙至全身各處。因此，膜微粒以上兩種信號(hào)傳遞的途徑不止可以發(fā)生在其周圍細(xì)胞，即使遠(yuǎn)離起源細(xì)胞的組織也可以受惠于其有益的修復(fù)作用。最近研究結(jié)果顯示，MSC-MP還可以趨化其他具有修復(fù)效應(yīng)的細(xì)胞及細(xì)胞因子遷徙至損傷部位，促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，從而達(dá)到損傷修復(fù)的目的[14]。MSC來(lái)源的膜微粒可能通過(guò)以上途徑，將生物活性蛋白、生物脂類及功能核酸分子轉(zhuǎn)入受損目的細(xì)胞，使受損細(xì)胞得到恢復(fù)或使周圍的固有干細(xì)胞增殖，分化為功能細(xì)胞，從而恢復(fù)器官功能。

4 膜微粒臨床應(yīng)用

研究證實(shí)，來(lái)源于MSC的膜微粒具有組織再生修復(fù)能力[15]和高效的免疫調(diào)節(jié)及細(xì)胞定向分化等功能[16]，多次直接心內(nèi)膜注射MSC是相當(dāng)安全的[17]。但是，F(xiàn)urlani等[18]發(fā)現(xiàn)靜脈注射MSC后，遠(yuǎn)端末梢毛細(xì)血管出現(xiàn)阻塞現(xiàn)象及部分出現(xiàn)心律失常。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，體內(nèi)直接植入MSC，發(fā)現(xiàn)MSC向成骨和成軟骨細(xì)胞分化，且在不同組織中出現(xiàn)骨化和鈣化現(xiàn)象[19]。膜微粒的直徑足夠小，不僅可以快速通過(guò)毛細(xì)血管，到達(dá)病損部位，而且可以通過(guò)膜上受體與受損細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而修復(fù)損傷組織；同時(shí)，也避免了直接注射MSC的不利生物學(xué)效應(yīng)，減少了臨床風(fēng)險(xiǎn)。膜微粒內(nèi)含物只有順利進(jìn)入目的細(xì)胞內(nèi)，才能發(fā)揮其修復(fù)作用[7]。這些因子可通過(guò)具有磷脂膜包被的膜微粒進(jìn)入細(xì)胞，方式可能包括與目的細(xì)胞的融合、配體結(jié)合、胞吞及胞飲等多種途徑[20]，從而將有效的生物學(xué)成分轉(zhuǎn)運(yùn)至特定的靶分子。這種活性物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方式，避免了體內(nèi)酶類及化學(xué)物質(zhì)的降解，保證了細(xì)胞因子及核酸的穩(wěn)定性、完整性及生物學(xué)能力。只要膜微粒的類脂膜不被破壞，膜微粒中的蛋白及RNA絕不會(huì)被胰蛋白酶及RNA酶降解[21]。膜微粒的膜表面存在為數(shù)眾多的膜蛋白（像轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、腫瘤壞死因子受體及結(jié)合素類等），與目的細(xì)胞配體及胞外基質(zhì)有高度的親和性。故而，在這些膜蛋白的作用下，膜微粒可以快速到達(dá)特異組織及微環(huán)境，同時(shí)，可能具有促使膜微粒內(nèi)容物快速進(jìn)入目的細(xì)胞的能力，加速治療蛋白或RNA進(jìn)入受損細(xì)胞。總之，膜微粒不僅具有MSC治療的生物學(xué)特性，而且消除了MSC實(shí)施的弊端，有可能成為再生醫(yī)學(xué)研究中新的關(guān)注點(diǎn)。

5 膜微粒應(yīng)用的前景及存在的問(wèn)題

膜微粒具有保存穩(wěn)定、方便，與目的細(xì)胞多途徑靶向性結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)，使其能夠特異性地作用于受損組織[22]。此外，MP的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)能夠阻止各種酶類對(duì)其生物分子的降解，從而達(dá)到高效修復(fù)的目的。然而，膜微粒的提取和制備等規(guī)范化問(wèn)題尚未解決，膜微粒與凋亡小體的分離、提純等問(wèn)題均需要科學(xué)的解決辦法。來(lái)源細(xì)胞狀態(tài)及微環(huán)境等均可影響膜微粒的生物學(xué)性質(zhì)及成分。Hood等[23]發(fā)現(xiàn)膜微粒可能通過(guò)促進(jìn)血管再生，從而具有促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)。這些安全隱患應(yīng)得到重視。

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