香菇菌C91-3凋亡相關蛋白24414對小鼠肝癌細胞Hca生物學功能的影響

劉 奔，鐘民濤，王曉麗，孫文長，寧安紅，李星云，劉 磊，黃 敏

(大連醫科大學 微生物學教研室，遼寧 大連 116044)

香菇菌C91-3具有氣味甘平、無毒、健脾益氣、扶正祛邪,調和陰陽的藥食兼用特點[1]。以往的研究表明其發酵液具有良好的抗腫瘤、抗細菌作用。其發酵液中除含有大量多糖和氨基酸成分外,還含有多種蛋白成分。經體內及體外實驗證實，其中的一些蛋白組分具有很高的誘導細胞凋亡的能力[2-3]。為明確香菇菌中蛋白的抗腫瘤作用，本課題組對其轉錄組進行了高通量測序，獲得了香菇菌C91-3的轉錄組序列。通過GenBANK、SWISS-MODEL等數據庫比對分析，初步篩選確定了其凋亡相關的轉錄組序列，并根據此轉錄組序列設計引物，用3′-Full RACE、5′-Full RACE(Rapid Amplificatioon of cDNA Ends)方法獲得了基因全長。通過畢赤酵母表達體系誘導表達出此目的蛋白，并將鑒定后的蛋白作用于小鼠肝癌細胞Hca，經流式細胞術等方法檢測其對腫瘤細胞Hca生物學功能的影響，進而分析其是否具有誘導腫瘤細胞凋亡的功能，為進一步深入研究香菇菌C91-3的抗腫瘤機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗儀器：低溫離心機：Eppendorf ，德國。 PCR擴增儀：Takara Thermal Cycler TP600，Takara BIO INC。超凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蚌埠凈化設備廠。核酸電泳儀：Mupid，ADVANCE-BIO Co.,Ltd。蛋白電泳儀：EPS300，上海天能。凝膠成像分析系統：北京六一實驗儀器廠?；驕y序儀：ABI PRISMTM3730XL DNA Sequencer，Applied Biosystem。

1.1.2 實驗試劑：總RNA提取Trizol試劑盒、Penta.His Antibody、HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)購自invitrogen公司，3′-Full RACE Core Set Ver 2.0 、5′-Full RACE Kit、BigDye Terminater V3.1 Cycle Sequencing Kit、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒及實驗所需各種引物、酶類均購自寶生物工程(大連)有限公司，各種培養基為本實驗室配置。

1.1.3 質粒、菌株與細胞株：質粒pPIC9K、菌株DH5α、畢赤酵母GS115購自invitrogen公司(中國)；小鼠肝癌細胞Hca購自中科院上海生化與細胞所；雞胚成纖維細胞，本實驗室制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 香菇菌C91-3總RNA提取與24414基因CDS區序列的獲得：取綜合馬鈴薯培養基培養18 d的香菇菌C91-3的菌絲體，于研缽中加入液氮充分研磨，用Trizol試劑盒按說明一步法提取總RNA，將所得總RNA溶于50 μL DEPC水中。引物設計采用oligo 6.0設計軟件，根據轉錄組測序結果，設計合成3′-RACE、5′-RACE實驗所需特異性引物，通過3′-Full RACE、5′-Full RACE反應得到香菇菌C91-3 24414基因CDS區序列。實驗所需引物序列如下：

(5′→ 3′)：3′RACE Outer Primer 1：GAAATGGTCCTAGTTCCCGTG； 3′RACE Outer Primer 2：TA-GATGCCAGGGACCGCTTCT； 3′RACE Inner Primer 1：CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG； 3′RACE Inner Primer 2： AGTAGGGCTTCATGTGCTT； 5′RACE Outer Primer 1：CCGGGAATGTGTCTGTTGTTA； 5′RACE Outer Primer 2：CCGTTTTACAAGTTT-TTCGTT； 5′RACE Inner Primer 1：CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG； 5′RACE Inner Primer 2：ATGCGCGTAGGTAGACTTTGA； F Primer：ACTGGCGCGTGAGCCACTCG； R Primer：GCCCTG-AGGTCCAAACATTG； R1seq primer：ACCTCGGCAACAAACCCCAA； 5′AOX I primer：GACTGGTTCCAATTGACAAGC； 3′AOX I primer：GGCAAATGGCATTCTGACAT。

1.2.2 酵母真核表達載體構建、陽性轉化子培養及誘導表達：構建真核重組表達質粒pPIC9K-24414，采用畢赤酵母GS115體系進行誘導表達，其目的蛋白末端加入6×His鑒定、純化標簽，得到鑒定的香菇菌C91-3凋亡相關目的蛋白24414[4]。

1.2.3 MTT法測定目的蛋白的抑瘤率：選取對數生長期的Hca小鼠肝癌細胞，調整細胞數為1×105個/mL，加于96孔培養板，每組設3個復孔，終體積200 μL。實驗分為5組：不同濃度目的蛋白3組，化療藥物順鉑(DDP)組與培養基空白對照組。所有成分用RPMI-1640配制，目的蛋白為鑒定后的誘導表達72 h的產物，分別稀釋至終濃度7.5 μg/mL、15 μg/mL、30 μg/mL，化療藥物DDP終濃度為5.0 μg/mL，于37 ℃作用于對數生長期的Hca細胞24 h、48 h、72 h后，用 MTT法進行檢測，測定波長595 nm，參考波長655 nm，按照下面公式計算抑瘤率(細胞生長抑制率)：IR(inhibited rate)=(對照組平均A值-實驗組平均A值)/對照組平均A值×100%。

1.2.4 目的蛋白對腫瘤細胞Hca凋亡作用檢測：細胞分組同上，選取對數生長期的小鼠肝癌Hca細胞，調整細胞數為1×105個/mL，加入25 mL培養瓶，每瓶3 mL。用藥及藥物作用濃度同上，混勻后，37 ℃，5%CO2孵育24 h，細胞懸液800 r/min，離心3 min，再以PBS洗滌1次，800 r/min離心3 min；按試劑盒說明加入Annexin/PI染液，避光孵育15 min后以流式細胞儀檢測，使用Cell Quest軟件進行分析。

1.2.5 目的蛋白對正常雞胚成纖維細胞毒性檢測：制備雞胚成纖維細胞懸液[5]，分組同上，調整細胞濃度至1×105個/mL，分裝于96孔板，二氧化碳培養箱中37℃培養24 h，觀察雞胚成纖維細胞貼壁良好時用藥同上，每組設3個復孔，37 ℃繼續培養，于24 h、48 h、72 h采用 MTT法進行檢測，測定波長595 nm，參考波長655 nm。

1.3 統計學方法

使用SPSS11.0統計軟件進行實驗數據分析，采用組間t檢驗，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結 果

2.1 香菇菌C91-3總RNA提取

取5 μL總RNA進行2%瓊脂糖凝膠電泳，marker上樣量為5 μL，結果見圖1，示RNA完整無降解。

2.2 香菇菌C91-3 24414基因CDS區獲得

RT-PCR反應結束后，取5 μL的RT-PCR反應液進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，marker上樣量為5 μL，確認PCR擴增產物，見圖2。在大約3000 bp處可見清晰條帶，條帶大小與拼接結果吻合，同時M-MLV逆轉錄酶陰性對照[M-MLV(-)]無條帶出現，示無假陽性結果。

圖1 香菇菌C91-3總RNAFig 1 Total RNA of Lentinus edodes C91-31：香菇菌C91-3總RNA； M：DNA Marker DL2000

圖2 香菇菌C91-324414基因CDS序列全長Fig 2 Full CDS sequence of Lentinus edodes C91-3 24414 gene

M：DNA Markerλ-Hind Ⅲ digest ；1：M-MLV(-)PCR 產物；2：PCR 產物

2.3 誘導表達目的蛋白的鑒定

通過Western-blot方法確認目的蛋白的表達情況，一抗稀釋倍數為1∶1000，二抗稀釋倍數為1∶1000，顯色底物為True Blue Peroxidase Substrate，反應條件均為室溫1 h,結果見圖3。在蛋白電泳大于110 kD位置處有抗His-Tag 陽性的蛋白條帶，空載體對照組無條帶。

圖3 誘導表達不同時間目的蛋白的鑒定

Fig 3 Characterization of target protein on different time span of induction

M：Precision Plus Protein Standards Dual color ； 1：24414-1胞外 (72 h)；2：24414-1胞外 (48 h)； 3：24414-1胞外 (24 h)；4：空載體pPIC9K 胞外 (48 h)

2.4 MTT法測定目的蛋白的抑瘤率

不同作用時間、不同濃度的目的蛋白對Hca細胞的MTT檢測結果，見表1，抑瘤率見表2。24 h后，蛋白作用組與DDP作用組的A值與對照組比較差異即有顯著性意義(P<0.05)，且蛋白作用組的A值與DDP作用組比較差異也有顯著性意義(P<0.05)。表2所示，Hca細胞在各濃度目的蛋白作用下，生長明顯受到抑制，其抑制水平超過5 μg /mL DDP的作用。

表1 不同時間、不同濃度的目的蛋白對Hca細胞的MTT檢測結果Tab 1 The MTT result of the expressed protein to Hca cell on different time span (±s)

1) 與對照組比較，P<0.05；2) 與5 μg/mL DDP組比較，P<0.05

表2不同時間、不同濃度目的蛋白對Hca細胞的抑瘤率

Tab 1 Cell inhibited rate of the expressed protein to Hca cell on different time span(%)

2.5 目的蛋白對腫瘤細胞Hca凋亡作用檢測

目的蛋白作用于Hca細胞24 h后，經Annexin/PI雙染色法染色，以流式細胞儀檢測細胞凋亡率，測量3次，以Cell Quest軟件分析檢測腫瘤細胞凋亡結果，見表3和圖4。圖4中，右上象限為晚期凋亡細胞，右下象限為早期凋亡細胞，左上象限為死亡細胞，左下象限為正常狀態細胞。結果表明，目的蛋白作用濃度為7.5 μg/mL時，其晚期凋亡率已高于對照組細胞，即對Hca細胞已具有誘導凋亡的作用，濃度為30 μg/mL時誘導凋亡的作用最強，早晚兩期凋亡率最高。腫瘤細胞在蛋白的作用下對理化作用的耐受性降低，細胞碎片增多，死亡細胞數目亦明顯增多。

表3 不同濃度的目的蛋白對Hca細胞的凋亡率Tab 2 The apoptosis rate of the expressed protein on Hca cell (%)

1) 與對照組比較，P<0.05

2.6 目的蛋白對正常雞胚成纖維細胞的毒性檢測

不同濃度目的蛋白對正常雞胚成纖維細胞的毒性檢測見表4。雞胚成纖維細胞在不同濃度的目的蛋白作用下生長沒有受到抑制，與對照組比較差異沒有顯著性意義。而在5 μg /mL 的DDP作用下，細胞生長在24 h即出現抑制，與對照組、各蛋白作用組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。

對照組目的蛋白組7.5μg/mL15μg/mL3μg/mL5μg/mLDDP24h1.817±0.0641.657±0.0891.789±0.1491.581±0.1400.773±0.4121)48h1.059±0.1000.990±0.0791.070±0.1541.118±0.1220.693±0.0901)72h0.939±0.0770.903±0.0810.931±0.1730.827±0.1090.522±0.0631)

1) 與其余4組比較，P<0.05

3 討 論

細胞凋亡是一個主動的、信號依賴的過程，它可以由許多因素所誘導，如放射線照射、毒素、藥物、缺血缺氧、病毒感染等。和細胞增殖一樣，細胞凋亡也是受基因調控的精確過程[6]。目前，已經證實的凋亡相關蛋白在腫瘤細胞的增殖及凋亡過程中均起到關鍵作用[7]。研究表明，香菇菌提取物除具有抗病毒、抗細菌及免疫調節等生物功能外還具有抑制腫瘤增殖的功能[8]。Liao CH等[9]從松衫靈芝中提取的真菌免疫調節蛋白能誘導體外培養的肺癌A549腫瘤細胞過早地凋亡和過早地衰老，證明了具有體外直接殺傷腫瘤作用的蛋白成分在藥用真菌中真實存在。Hsu HC等[10]從草菇中分離的真菌免疫調節蛋白在體外對腫瘤細胞具有直接抑制作用，進一步證明從真菌中可以分離得到具有直接抗腫瘤作用的蛋白。本課題組從香菇菌C91-3菌絲體發酵液中提取的蛋白LFP91-3就已在抗多種腫瘤細胞的實驗中取得了良好的結果[2-3]， 并已證實該發酵液蛋白具有體外抗腫瘤和體內直接殺傷腫瘤細胞的作用[2,11]。

本課題組通過轉錄組測序、凋亡相關蛋白序列比對、真核表達載體構建、酵母系統表達等手段得到了香菇菌C91-3凋亡相關蛋白24414，目的蛋白在1%甲醇誘導后24 h即有表達，表達量較恒定，經檢測在72 h達到峰值0.3 mg/mL[4]。MTT法進行體外抗腫瘤活性的測定，發現該蛋白對腫瘤細胞Hca具有明顯的抑制作用，7.5 μg /mL、15 μg /mL、30 μg /mL目的蛋白的抑制率在24 h分別為50.49%、72.84%和72.96%。作用48 h后，15 μg /mL、30 μg /mL目的蛋白組出現組內最大抑制率，分別為82.02%和74.66%，可以看出此蛋白對Hca細胞的抑制率不完全是時間、濃度依賴性的。作者分析這與生長抑制作用通路中的某些因素有關，其具體機制需要深入研究。作用24 h后，通過流式細胞儀檢測，目的蛋白作用濃度為7.5 μg/mL時，早期凋亡率和晚期凋亡率分別為0.47%和4.26%；目的蛋白作用濃度為30 μg /mL時，早期凋亡率和晚期凋亡率分別達到9.28%和9.37%，兩期凋亡率均隨蛋白作用濃度增加而增加，晚期凋亡略占優勢。此結果證實，該蛋白具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，在作用24 h時腫瘤細胞出現的早期凋亡率和晚期凋亡率隨著單一蛋白作用濃度的增加而增加，表現出劑量-效應關系。同時，從毒性檢測的結果中可以看出此蛋白對正常雞胚成纖維細胞無毒性作用，雞胚成纖維細胞在不同濃度的目的蛋白作用下生長沒有受到抑制，與對照組比較差異沒有顯著性意義。這一結果表明該蛋白誘導細胞凋亡具有腫瘤細胞選擇性，其具體的誘導腫瘤細胞凋亡的機制、途徑有待研究。

目前的抗癌藥物多是通過誘導細胞凋亡發揮其細胞毒副作用。但幾乎所有的抗癌藥物都存在不同程度的毒副作用?？拱┧幬锏囊至鲂Ч投靖弊饔脤ζ鋭┝看嬖诘囊蕾囆?產生了治療與毒副作用的矛盾[12]。因此,篩選低毒或無毒副作用且抑癌效率高的抗癌藥物具有很高的臨床價值。本課題組將繼續對此蛋白的分子結構、理化性質、生物學功能進行深入研究。

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