強力霉素與透明質酸鈉對兔骨關節炎的影響及其作用機制的研究

吳茂聰，鄭維好

(1.茂名市人民醫院 骨外科，廣東 茂名 525000; 2.大連醫科大學 附屬第二醫院 骨外科，遼寧 大連 116027)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是最常見的一種退行性骨關節病，主要以關節軟骨細胞外基質成分逐漸降解、丟失為特征，臨床表現為關節疼痛，關節間隙變窄，關節功能障礙。近年來，人們對軟骨結構、生化組成及代謝變化的認識增多，大量證據表明Wnt/β-catenin信號通路的啟動在OA軟骨的退變中起著十分重要的作用。本研究用強力霉素(doxycycline，DOX)口服和透明質酸鈉(hyaluronic acid，HA)關節腔內給藥治療兔OA模型，探討其治療價值及作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物及試劑

成年健康新西蘭白兔(大連醫科大學動物實驗中心)；透明質酸鈉注射液(山東博士倫福瑞達制藥有限公司)；強力霉素(廣東華南制藥廠)；兔β-連環蛋白酶聯免疫檢測試劑盒(大連晨鈺生化有限公司提供)。

1.2 實驗動物分組及模型的建立

成年健康新西蘭白兔25只，雌雄不限，體重1.7～2.0 kg，分為DOX組、HA組、DOX+ HA組、模型組和正常組，每組5只。除正常組外，所有動物均用切斷雙側膝關節前、后交叉韌帶的方法建立OA模型。術后第9周起，DOX組予強力霉素40 mg/(kg·d)灌胃治療，HA組予透明質酸鈉注射液每周5 mg膝關節腔內注射，DOX+HA組予強力霉素40 mg/(kg·d)灌胃+透明質酸鈉注射液每周5 mg膝關節腔內注射，模型組和正常組不予任何治療。第17周處死各組動物， 觀察比較。

1.3 組織取材

先行膝關節大體觀察，按以下原則評分：關節面光整，色澤如常，為0分；關節面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗，為1分；關節面糜爛，軟骨缺損深達軟骨表中層，為2分；關節面潰瘍形成，缺損深達軟骨深層，為3分；軟骨剝脫，軟骨下骨質暴露，為4分[1]。然后小心用刀片分別將各個膝關節股骨髁及脛骨平臺負重區軟骨削下，放入-80 ℃冰箱，待其僵硬變脆后，取出迅速用碾缽碾成粉末，并轉移至干凈試管。每個膝關節算一個標本。每100 mg粉末組織加入2 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，試管浸浴于冰水中，用超聲勻漿器勻漿2 min。再將勻漿物以3000 r/min離心5 min后，取上清液分裝于EP管中-20℃保存備檢。

1.4 檢測指標

用ELISA雙抗體夾心法檢測各組標本軟骨細胞中β-連環蛋白表達水平。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 大體解剖觀察

DOX、HA、DOX+HA三組軟骨改變以糜爛粗糙為主，部位集中在股骨髁部。模型組軟骨改變仍集中在股骨髁關節面，以潰瘍形成為主，其中2例出現軟骨剝脫。對照組軟骨表面沒有明顯改變。表1示16周后大體觀察軟骨不同評分例數，給藥組軟骨退變明顯輕于模型組(P<0.01)。

表1 16周后大體觀察軟骨不同評分

Tab 1 The number of cases of different ratings in the general observation of cartilage after 16 weeks (n)

2.2 各組兔膝關節軟骨中β-連環蛋白表達水平的比較

模型組軟骨中β-連環蛋白表達比正常組明顯增多(P<0.01)；與模型組相比，DOX組、HA組和DOX+HA組軟骨中β-連環蛋白表達均明顯減少(P<0.01)；DOX+HA組β-連環蛋白表達低于DOX組和HA組(P<0.01)；DOX組和HA組β-連環蛋白表達水平比較差異無顯著性意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組兔膝關節軟骨中β-連環蛋白表達水平的比較Fig 1 Comparison of β-catenin expression in the rabbit knee cartilage of each group

#：與正常組比較，P<0.01；▲：與模型組比較，P<0.01；★：與DOX+HA組比較，P<0.01

#：Compared with normal group，P<0.01；▲：Compared with model group，P<0.01；★：Compared with DOX+HA group，P<0.01

3 討 論

骨關節炎(OA)是一種以關節軟骨變性、破壞及骨質增生為特征的慢性關節病，其臨床表現主要為受累關節疼痛、畸形及功能障礙。其發病與肥胖、創傷、遺傳、內分泌、血管病變等因素有關[2]。近年來國內外不少報道都認為Wnt/β-catenin信號通路在OA的發病中發揮著十分重要的作用[3-5]。β-連環蛋白是Wnt/β-catenin信號通路的樞紐分子，其在胞質內的穩定和累積是軟骨退變最關鍵的事件之一。

據報道，某些四環素類抗生素，如強力霉素(DOX)可通過抗炎、抑制MMPs和NO生成、調節細胞因子和免疫作用等多種途徑抑制軟骨的退變，改善軟骨結構[6-9]。最近，不少研究已證實軟骨細胞內β-連環蛋白的增加啟動Wnt/β-catenin信號通路，作用于靶基因，導致MMPs生成增加[10-11]。MMPs是一族結構相似的蛋白水解酶類的總稱，幾乎可以降解全身各組織的細胞外基質，它的增加是導致OA軟骨退變的重要原因之一。本研究DOX組軟骨β-連環蛋白的表達水平較模型組明顯降低(P<0.01)，且其膝關節囊增厚、滑膜組織充血、關節滑液量、髕股關節軟骨面及股骨髁負重面軟骨損傷、軟骨表面潰瘍等病變均較模型組減輕。這說明DOX可抑制β-連環蛋白在軟骨細胞內累積，減少MMPs的生成，阻止軟骨基質的降解。目前，DOX抑制Wnt/β-catenin信號通路的具體機理仍有待研究。

透明質酸鈉(HA)主要由軟骨細胞和滑膜B細胞分泌，是關節滑液和軟骨基質的重要成分。OA的發病是以關節軟骨退變開始，關節腔內的分解酶加速了HA的分解，從而失去HA對關節軟骨的保護作用，導致關節軟骨的進一步破壞。所以近年來，以HA為代表的氨基糖類粘彈性物質補充療法，在防治OA的基礎研究和臨床應用上取得了良好的效果，為OA治療提供了新的途徑[12]。通過關節腔內注射外源性的HA有下列作用：(1) 提高關節滑液中HA含量，使其在軟骨及滑膜表面重新形成屏障，防止軟骨基質進一步破壞及降解。(2) 改善病理狀態下滑液的生物學功能，減輕或消除關節摩擦及疼痛，發揮對滑膜和軟骨的潤滑及保護作用，改善關節運動功能。(3) HA可與已釋放于滑液中的糖蛋白形成聚合物，抑制炎癥反應，修復損傷軟骨。(4) 抑制白細胞移動、趨化作用 ，降低滑膜的通透性，減少關節腔滲出液。(5) 覆蓋及保護痛覺感受器，與疼痛介質結合，緩解疼痛，使病人膝關節活動范圍明顯改善[13]。本研究發現，HA補充治療兔膝關節OA后，關節退變較模型組減輕，軟骨中β-連環蛋白的表達水平較模型組明顯降低(P<0.01)。因此猜測補充HA能降低關節軟骨中β-連環蛋白的水平還與其形成的屏障作用有關：(1)提高了關節滑液中HA含量，使其能在軟骨和滑漠表面重新形成屏障，阻斷了軟骨細胞外的細胞因子(Wnts)與膜受體Frizzled結合，避免信號轉導進胞內引起β-連環蛋白的累積。(2)炎癥能抑制Wnt/β-catenin信號通路的拮抗劑DKK-1的表達，啟動Wnt/β-catenin信號通路，導致軟骨退變[14]，補充的HA可在軟骨表面形成自然屏障，并恢復關節滑液的粘彈性，阻止炎性介質的釋放和擴散，避免Wnt/β-catenin信號通路的異常啟動。(3) HA使關節疼痛緩解，關節活動度增加，后者又促進了滑液的回流、吸收，使局部堆積的炎性介質、組織代謝產物得以清除，從而改善了關節內環境，緩解和阻斷了關節局部病變的惡性循環。

目前，干擾OA關節結構退變進程和保持正常關節功能已成為OA治療的一種新理念。DOX能減少MMPs的生成，阻止軟骨基質的降解，阻斷關節退變進程。HA針對病變部位給藥，能有效地緩解癥狀，改善關節功能，比其他非局部使用的藥物發揮作用更直接迅速。本研究DOX和HA聯合應用治療OA，療效好于兩藥單獨應用，正符合了治療OA的新理念。隨著對DOX和HA抗OA作用機制的進一步了解，可能為OA的臨床治療提供一種新的治療方式。

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