定量檢測毒品的蛋白芯片的研發

曾立波，陳連康，胡小龍，陳復華，丁國榮，張玉榮，張潤生，梁晨，曹芳琦

（上海市公安局物證鑒定中心，上海市現場物證重點實驗室，上海200083）

隨著非法制毒、販毒、吸毒的案件日趨增加，送檢的毒品檢材在數量和種類上都比以前明顯增多。目前在檢驗鑒定工作中存在以下問題：常規的檢驗技術是儀器分析，存在以下不足：（1）檢測通量低，儀器每次只能對一個樣品或一種毒品和毒物成分進行檢驗鑒定，如果遇到嚴打專項斗爭和發生特發事件，成百上千份樣本的測定和幾十種毒品需要定性篩查時，此法便顯出了其通量小的缺陷；（2）檢測速度慢，分析操作周期長和煩瑣，一個樣品的檢測時間約需幾小時以上，難以在廣大基層單位推廣，更不能在現場高通量快速檢測。

生物芯片技術是九十年代中期興起的一種新型生物學技術，它的特點是將生命科學研究中所涉及的樣品反應、檢測、分析等過程連續化、集成化、微型化。由于其檢測信號的高通量、良好的檢測靈敏度和數據回收率，生物芯片技術迅速成為目前生命科學研究領域發展最快的技術之一[1]。

蛋白質芯片，又稱蛋白質陣列或蛋白質微陣列，基于抗原和抗體專一性結合的原理，將多種蛋白質有序地固定在固相載體（如：特殊處理的玻片、有機膜片、硅微球等）表面形成微陣列，檢測生物樣品中可與之專一性結合的對應蛋白質[2]。用標記了熒光的蛋白質，經熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點的熒光強度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關系。本項目利用蛋白芯片檢測毒品毒物的基礎是免疫反應。預先在固相基質上通過化學方法固定載體蛋白偶聯的毒品毒物小分子，檢測過程中將毒品毒物抗體與待測樣品同時加入，樣品種的毒品毒物與固定在基質上的小分子完全抗原針對毒品毒物抗體進行競爭免疫反應，沒能結合在芯片上的抗體在洗滌步驟中被除去，然后加入熒光標記的二抗進行孵育，最后通過芯片掃描儀獲得檢測結果[3]。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

嗎啡和甲基苯丙胺單克隆抗體、嗎啡和甲基苯丙胺等毒品與牛血清白蛋白的偶聯物（MOR-BSA，METBSA）為本實驗室自制；硝酸纖維素膜為Whatman公司產品；嗎啡和甲基苯丙胺等毒品標準品為公安部第二研究所提供；高速冷凍離心機為上海飛鴿離心機廠產品；點樣系統AD 1500為Bio-dot公司產品；掃描儀InnoScan 710購自INNOPSYS；Cy5熒光標記 （上海開放生物科技有限公司）；小牛血清白蛋白（Sigma公司）；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 毒品完全抗原的制備（以嗎啡為例）

采用琥珀酸酐法：稱取硫酸嗎啡20mg，與3倍的琥珀酸酐在苯中回流反應4h，蒸干溶劑，用乙醇洗滌，得到6-琥珀酰嗎啡（M-6-S）的固體粉末。6-琥珀酰嗎啡與蛋白質的連接采用碳二酸酐法：稱取，10mg的BSA（牛血清白蛋白）溶于10mL PBS（磷酸鹽緩沖液）中，加入60mg EDC（碳二亞胺）室溫下攪拌下反應2～3 h，將反應液10 000 rpm離心除去不溶物，將1.3.1中的6-琥珀酰嗎啡（M-6-S）20mg，溶于500uL H2O中，逐滴滴入BSA（牛血清白蛋白）溶液中，室溫反應12h。反應產物在4℃，用0.01M，pH 7.4磷酸鹽緩沖液透析，期間更換緩沖液3～4次，以除去未反應的小分子物質。最后用紫外光譜法鑒定，即得完全抗原。其它毒品均通過類似方法引入活性基團，再與載體蛋白通過交聯劑偶聯獲得完全抗原。

5mg羊抗鼠IgG多抗溶于2.5ml 0.1M pH8.3的碳酸緩沖液，將Cy5 NHS easter（羥基琥珀酰亞胺酯）溶于DMF濃度為10 mg/ml，加入100 ul的Cy5 NHS easter到抗體溶液中，室溫下反應2h，用G25柱除去小分子，標記好的抗體儲存于4℃。

1.2.3 毒品蛋白芯片的制備

包括如下步驟：將含有活化基團的硝酸纖維膜芯片片基；置于自動點樣儀中，用緩沖液進行梯度稀釋的毒品偶聯物抗原和質控蛋白進行精確點樣，將10nL的毒品偶聯物（濃度在300~500ug/mL）地點在固體芯片上進行包被。室溫下（25℃）放置3h使之干燥；用含3%BSA 0.5%Tween-20 0.5%PVA（Polyvinyl alcohol）的0.01M pH 7.4的PBS封閉1h；用雙蒸水沖洗后在真空干燥箱內干燥，干燥劑、密封4℃保存。形成分離測試區域，而且不會破壞抗體的組成和構造。抗體溶液的分配量由電腦嚴格控制，保證可以精確的應用到芯片表面。

1.2.4 毒品蛋白芯片的靈敏度及線性的檢測

將制備好的芯片用雙蒸水清洗，晾干后，將毒品抗體以1：500稀釋，加到芯片上，孵育30min，PBS-T洗滌4次，每次10 min，最后用雙蒸水沖洗，再加入1：2000 CY5的標記羊抗鼠IgG多抗，孵育30 min，PBS-T洗滌后用ScanArray3000掃描儀掃描，用圖像分析軟件進行熒光強度分析。計算各每個矩陣的平均熒光強度，所得數據進行線性回歸分析。確定線性范圍和最低檢出濃度。

1.2.5 毒品蛋白芯片的準確性研究

通過對506例樣本的檢測，同時GC-MS樣本中毒品的含量，以每種毒品的閾值為陰性、陽性的判斷標準，將毒品芯片檢測結果與GC-MS結果比較，得到最終的總符合率，確定毒品蛋白芯片檢測的準確性。

1.2.6 毒品蛋白芯片的穩定性研究

在無際的黑夜里，你想過曾經最愛的文字。從前你將它們想象成可以在指尖躍動的音符，每翻開一本書時它們便蹦跳著，奔跑著，在透明的空氣里穿針引線，在你的耳朵里纏繞出琴弦，演奏出那一首獨屬于你的“小確幸”。你提筆創作的時候是你最耀眼的時候，就像陽光在你的身上鍍了一層淺淺的金。你認真地譜寫曲子，一曲終了，酣暢淋漓。

評估芯片微陣列的穩定性，將毒品檢測芯片儲存在37℃下28 d，并且信號強度在28 d研究之前和之后各確定一次。

2 結果

2.1 毒品蛋白芯片的標準曲線

競爭測定方法適用于毒品小分子的檢測，如果樣本中含有毒品，它會與完全抗原競爭抗體結合位點。這將會降低標記的抗體的結合的數量，發光信號會減弱。在競爭反應中，光信號的強弱與樣本中出現的毒品的濃度成相反的比例關系。用梯度稀釋的毒品標準品制備出芯片的標準曲線，為典型的免疫競爭反應曲線（見圖1）。四參數logistic分析的回歸方程：Y=（A-D）/[1+（X/C）^B]+D，R2=0.99165其中X代表樣本濃度（ng/ml），Y代表化學發光信號強度，A、B、C、D為競爭性測定參數。

圖1 用嗎啡標準品制備的芯片檢測的標準曲線

2.1 與GC/MS結果比較結果

用芯片對多個尿樣樣本的進行幾種常見毒品的定量檢測，檢測結果與GC-MS檢測結果比較，結果顯示毒品芯片與GC-MS檢測具有較高的相關性，嗎啡、甲基苯丙胺、苯丙胺和氯胺酮的相關性分別為：88%，93.2%，94.1%和90.6%（見表1）。

2.2 芯片檢測的毒品種類和靈敏度

本項目制備的毒品檢測芯片的靈敏度如以圖表所示，和目前的膠體金快速檢測試劑盒相比較，其尿液中檢測所有毒品的靈敏度均提高了10倍以上（見表2）。

2.3 特異性

在芯片的特異性檢測試驗中，我們選用苯丙胺，甲基苯丙胺。氯胺酮，去甲氯胺酮，嗎啡，美沙酮，度冷丁，海洛因，麻黃素，左旋麻黃素，右旋麻黃素，MDMA，可待因，大麻，可卡因，咖啡因，氯丙嗪，布洛芬，蒂巴因，四氫大麻酚，利多卡因，那可丁，阿普唑侖，福爾可啶，喃氟啶，苯噻啶，安定，三唑侖，比沙可啶，苯乙哌啶，硝苯啶，卡馬西平，硫唑嘌啶，阿托品，氨苯蝶啶，氟哌啶醇，甲磺酸雙麥角毒堿，丁丙諾啡，苯丙醇胺和苯乙胺共40種毒品和藥品。作為特異性檢測的干擾物質，進行檢測，結果顯示，本項目制備的毒品檢測芯片基本上未發生任何交叉反應。特異性達到99%。

2.4 穩定性

將毒品檢測芯片儲存在37℃下28d，并且信號強度在28d研究之前和之后各確定一次。結果顯示此種芯片可以在下37℃下28d。

3 討論

膜基片主要適用于制備陣列型的蛋白質芯片，同時也適用于各種多肽、核酸、碳水化合物以及小分子化合物等各類生物信號分子的微陣列制備[4]。化學膜的優點在于不需要做點樣前的復雜表面處理，就可以進行點樣，但容易造成較高的背景，降低檢測的靈敏性[5]。用噴墨打印頭將蛋白質樣品噴點到固相介質上形成陣列，可以通過電腦程序自動精確控制，效率很高，能夠制備較高密度的蛋白質芯片，是今后制作高密度蛋白質芯片的主要方法。膜的參數可調節，如膜厚、生物信號分子的密度、功能基團等。可根據要求選擇基片。

制備微陣列的一個共同問題是，每個分離測試區（DTR）分配液滴的干燥期間，會形成“環形污點”或者“圓形圖”。干燥期間會集中在液滴周圍形成圓環形的非特異性信號[6-7]。這些圓環形的點會在某種程度上影響檢測的精確性和重復性。在研制過程中，我們發現點樣所用的緩沖液的性質是“環形污點”出現的關鍵因素，同時，點樣緩沖液也是決定DTR形狀和穩定性的關鍵因素。采用添加一定量的蔗糖和海藻糖（6%～20%）不會降低光信號強度，同時對包被的抗原具有極大的穩定作用。

表2 芯片檢測常見的毒品種類和靈敏度 單位：（ng/ml）

表1 芯片檢測結果與GC-MS結果比較

封閉的目的是消除檢測中的非特異結合，提高檢測的信噪比。除此之外，封閉還可以有一定穩定作用。本文中制備的芯片采用磷酸鹽緩沖液和3%小牛血清白蛋白，加入0.5%的Tween-20和0.5%PVA（Polyvinyl alcohol），具備良好的親水性，每個分離測試區（DTR）邊緣清晰，信號較強并且背景很低。

Cy5是目前常用的蛋白熒光標記物，吸收/發射波長為：650nm/667nm，為紅色熒光。具有背景低、靈敏度高的特點。我們采用CY5 NHS ester（羥基琥珀酰亞胺酯），與蛋白交聯效率高，操作簡單，適合大批量制備。與目前有些蛋白芯片所使用的過氧化物酶的化學發光或顯色方法相比，最大的優點是無需顧及酶和底物的活性和污染問題。

毒品芯片的檢測具有高通量、靈敏度和自動化程度高的特點，可以根據自身的需求制備不同毒品種類的組合陣列芯片，對于芯片制作過程中每個步驟的精確控制，比如點樣過程中的量的控制，封閉過程的控制以及標記效率的控制等，都是解決蛋白芯片批量生產中的批間差和批內差的關鍵，本文所闡述的研究過程和結果是毒品芯片檢測試劑盒的前期數據，要制備出產品化的毒品芯片檢測試劑盒，還必須制定一整套生產和質量控制的標準方法，以滿足實際應用的需求。

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