鄂產竹節參的HPLC-DAD特征圖譜研究

楊 桃，陳 新，李 龍，許 旭，胡 海，吳江磊，何 舟

(武漢工業學院生物與制藥工程學院，湖北武漢430023)

竹節參 Panax japonicus C.A.Mey.為五加科人參屬多年生草本植物的干燥根莖Rhizoma Panacis Japonici［1］，是我國名貴中藥材中常用藥材之一［2］，在心血管系統、神經系統、消化系統、免疫系統方面均具有藥理活性［3］;竹節參中含有多種化學成分如糖類、皂苷類、黃酮類、揮發油類、含氮化合物、無機鹽等，現代藥理及多種文獻報道表明其主要活性成分為皂苷類化合物，竹節參皂苷具有抑制腫瘤，鎮痛抗炎，鎮靜，免疫調節等多種藥理活性［4-7］，因此對竹節參進行系統的研究與開發具有一定的現實意義。

目前，HPLC指紋圖譜在中藥材制劑質量控制方面的運用逐漸受到多方重視，但指紋圖譜的建立通常是以1種或幾種指標成分作為對照為基礎的，并沒有對復雜多樣的中藥化學成分之間可能存在的協同作用進行考慮。因此，全息圖譜逐漸被引入中藥材的質量控制之中［8-9］。本文根據竹節參中總皂苷類化合物的化學性質，確定該類化合物的提取方法，并結合TLC、UV及HPLC全息圖譜，對竹節參總皂苷定性分析，對該化合物進行指認，并為竹節參指紋圖譜的建立提供一個很好的補充。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

竹節參(購于亳州藥材市場)。

1.1.2 試劑試藥

無水乙醇(分析純)、超純水、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純);竹節參皂苷Ⅳa、楤木皂苷A、竹節參皂苷Ⅰb、竹節參皂苷ⅴ(前期試驗中制得，純度＞98%，經核磁檢測并鑒定其結構)

1.2 儀器與設備

Agilent 1260分析型單元液相色譜儀(美國安捷倫公司)，DAD檢測器(G1315D 1260 DAD VL)，柱溫箱(G1316A 1260 TCC);Molresearch1010A超純水器-摩爾分析型超純水器(重慶摩爾水處理有限公司);Ar2140型電子天平(沈陽龍騰電子有限公司;SB-5200雙頻超聲清洗機(寧波新芝生物科技有限公司);BUCHI旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)。

1.3 樣品溶液的配制及色譜條件

1.3.1 竹節參皂苷提取物的制備

取干燥的竹節參粗粉1g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇溶液100 mL，設定水浴溫度80℃加熱回流，回流提取3h，共提取三次，合并三次提取的濾液并濃縮，用70%乙醇定容于100 mL容量瓶中，得濃度為10mg原料/mL的供試品液，用0.45μm的微孔濾膜過濾，作為竹節參總皂苷提取物的供試品溶液，待測定。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：Apollo C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);檢測波長：203 nm;柱溫：30 ℃;流速：1 mL· min-1;進樣量：20 μL;流動相：流動相A(0.05%磷酸水溶液)與流動相B(乙腈)進行梯度洗脫，洗脫比例如表1。

表1 梯度洗脫流動相

1.3.3 TLC展開條件

取少量濃縮后的提取物于EP管中，加適量甲醇稀釋，點樣于硅膠G板上，置于展開條件為氯仿∶甲醇∶甲酸(2∶1∶5‰)的展開缸中，展開后噴以10%硫酸乙醇溶液顯色，觀察硅膠板上的斑點情況。

2 結果與分析

2.1 竹節參皂苷提取物的TLC圖譜

用硫酸試劑顯色后的硅膠板如圖1所示，板上呈現清晰的紅色斑點，根據皂苷類物質的顯色特征，可以初步判定為皂苷類化合物。

圖1 竹節參總皂苷提取物TLC圖

圖1中原點為竹節參總皂苷提取液濃縮后樣品，1—4分別為竹節參皂苷Ⅳa，楤木皂苷A，竹節參皂苷Ⅰb、竹節參皂苷ⅴ對照品，通過原液與對照品的Rf值大小的比對，及原液與對照品顏色的相似程度可以初步判斷原液中含有該四種竹節參皂苷成分。該薄層色譜的展開條件是根據皂苷類化合物的性質通過多次實驗摸索篩選優化而來。在展開劑中加入少量醋酸，是為了防止酸性皂苷產生拖尾現象。本文所用方法制備總皂苷提取物，簡便易行。所用展開方式，快捷并且展開效果較好。

2.2 總皂苷提取物的HPLC—DAD圖譜

根據《中國藥典2010版一部》［10］，竹節參皂苷的HPLC檢測波長為203 nm，在此波長條件下按照1.3.2色譜條件進樣，樣品的HPLC圖譜見圖2。

圖2 竹節參皂苷提取物高效液相圖譜

圖3 竹節參皂苷全局三維圖譜

分析圖2可以看出，有部分物質由于濃度較小，在此圖上呈現出小峰。根據文獻報道［11］，四個峰面積最大的峰即1，2，3，4號峰為竹節參皂苷的主要成分。圖3為竹節參皂苷的全局三維圖譜，它采用光電二極管陣列作為檢測元件，構成多通道并行工作，同時檢測由光柵分光，再入射到陣列式接收器上的全部波長的光信號，然后對二極管陣列快速掃描采集數據，得到吸收值(A)是保留時間(tR)和波長(l)函數的三維色譜光譜圖。由此可及時觀察每一個竹節參皂苷組分的色譜圖相應的光譜數據，從而迅速獲得竹節參皂苷的紫外信息。

圖2中標注的竹節參皂苷色譜峰對應的UV光譜圖如圖4所示。紫外分光光度法測定的是總皂苷，由于竹節參中皂苷大多為齊墩果烷型［12］，該類型的皂苷在波長為200 nm—400 nm處紫外吸收不明顯，只有末端吸收，圖4中1—4號峰的保留時間與該類型皂苷的紫外光譜一致，所以在利用UV測定時，在該波長范圍內無明顯紫外吸收的特征即可作為鑒定竹節參皂苷的依據。

圖4 竹節參皂苷提取物的UV光圖

3 結論

竹節參總皂苷具有抗炎鎮痛及抗疲勞等活性，雖然竹節參皂苷種類繁多，除四種主要成分以外，其它皂苷的含量并不高。HPLC-DAD可對竹節參總皂苷成分進行有效地分離，同時可對皂苷主要成分色譜峰的紫外特征譜初步定性。目前，對皂苷類化合物的全息三維圖譜分析還鮮有文獻報道，本論文結合TLC、UV及三維圖譜法同時對竹節參藥材進行鑒定，方法簡便、重現性好、專屬性強，并且該法對竹節參總皂苷指紋圖譜的建立是一個很好的補充。在中藥化學成分的分析中，多波長指紋圖譜適應復雜性的科學要求，實質是從多維信息角度揭示指紋圖譜代表的整體化學指紋系統的全信息，它較單波長指紋圖譜更能全面地反映中藥的化學物質信息。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［M］.北京：化學工業出版社，2010：129-129.

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［3］ 林先明，由金文，劉海華，等.竹節參開花結果習性觀察［J］.湖北農業科學，2006，45(3)：347-348.

［4］ 吳錦忠，易駿，林小峰，等.人參屬四種植物中氨基酸和無機元素的比較研究［J］.貴陽醫學院學報，1992：17(3)：230.

［5］ 陳永波，饒斌，沈艷芬，等.竹節人參中氨基酸和皂甙特征組分的分析鑒別［J］.色譜，2003，21(3)：248.

［6］ 張玉濤，趙榮飛，劉和，等.黔產竹節參總黃酮苷的提取與測定方法研究［J］.安徽農業科學，2009，37(33)：16371-16372.

［7］ 陳永波，饒斌.竹節人參中氨基酸和皂苷特征組分的分析鑒別［J］.色譜，2003：248-250.

［8］ 孫國祥，吳波，畢開順.平行五波長高效液相色譜指紋圖譜全息整合法定量鑒定杞菊地黃丸的整體質量［J］.色譜，2010，28(9)：877-884.

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［10］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［M］.北京：化學工業出版社，2010：7-7.

［11］ Rufeng Wang，Ping Chen，Fang Jia，et al.Optimization of polysaccharides from Panax japonicus C.A.Meyer by RSM and its antioxidant activity［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2012，50，331-336.(SCI)

［12］ 陳永波，饒斌，沈艷芬，等.竹節人參中氨基酸和皂苷特征組分的分析鑒別［J］.色譜，2003(3).