以SRY為靶基因建立免疫耐受嵌合的定量檢測方法

瞿永華，方 成

(武漢工業學院醫學技術與護理學院，湖北武漢430023)

器官移植是器官功能衰竭的最終治療手段，免疫抑制劑的應用對解決抑制排斥反應、延長患者生存時間起到了重要作用。但是，免疫抑制劑的終生使用，除了經濟負擔外，藥物使用的副作用也給移植患者帶來十分不利的影響［1］。器官移植最理想的狀態是針對供體移植物建立特異性免疫耐受，受體在不使用免疫抑制劑的條件下不產生對移植物的排斥反應。而誘導和維持免疫耐受的機制之一就是在受體體內建立嵌合體。

本實驗室試圖研究供體造血干細胞在受體內增殖的條件，實現嵌合，達成免疫耐受。我們設計以雄性大鼠為供體，雌性大鼠為受體，以性別決定因子Y(SRY)作為檢測指標［2］，利用實時熒光定量聚合鏈反應(RT-PCR)技術［3］，建立大鼠的同種異體移植血細胞嵌合率的檢測方法，從而監測受體免疫耐受的狀態。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性近交系Lewis大鼠(北京維通利華公司)與雌性DA大鼠(哈爾濱醫科大學第二附屬醫院實驗動物中心)的新鮮血樣。

1.2 儀器

Stepone熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，分光光度計DNA定量(EPPENDORF公司)，DNA電泳(北京六一)。

1.3 試劑

1.3.1 DNA提取試劑盒(TOYOBO公司)，SYBR Green I染料(TOYOBO公司)。

1.3.2 引物序列：①上游引物：5'-ATACTGGCTCTG CTCCTACC-3';②下游引物：5'-CCCCTCTCCCAC CTCCCACTTTAGC-3'［4］。均由上海英俊公司合成。

1.4 實驗方法

1.4.1 標準品的建立

取雄性大鼠心臟新鮮血樣，按DNA提取試劑盒標準程序抽提 DNA，獲取DNA溶液500 μL。測定樣品起始DNA濃度為4.00×103μg/L，分別稀釋至100，10-0.5，10-1，10-1.5，10-2，10-2.5，10-3倍數建立陽性質控標準樣品。即所含陽性拷貝數是原始濃度的100%，31.6%，10%，3.2%，1%，0.3%，0.1%，濃度依次為4.00×103μg/L，1.26×103μg/L，4.00×102μg/L，1.26 ×102μg/L，4.00 ×101μg/L，1.26×101μg/L，4.00×100μg/L。陰性標準品即雌性大鼠血樣DNA測定樣品濃度為1.8×103μg/L。

1.4.2 實時熒光定量PCR

在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步，熒光信號被熒光監測系統接收，當信號增強到設定的熒光閾值，即時的PCR循環次數(Cycle)即Ct值。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系［5］，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值。對待測樣品只要用定量PCR儀測得Ct值，利用標準曲線即可得到該樣品的起始拷貝數。10 μL的PCR反應體系包括：DNA樣本 1 μL;ddH2O 3 μL; 混合引物1 μL;SYBR Green PCR Master mix 5 μL。PCR 反應條件：95 ℃ 60s—95℃ 15s—60℃ 15s—72℃ 45s(40個循環)。收集PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀測目的條帶顯色情況。

1.4.3 定量結果分析方法

以樣品稀釋率的負對數值為橫坐標，Ct值為縱坐標，則得到嵌合率曲線。用定量PCR儀測得未知樣品的Ct值，利用標準曲線即可計算出該樣品的稀釋率。

2 結果與分析

2.1 雌性和雄性大白鼠血細胞DNA的提取

雄性大鼠SRY序列作引物，分別以雌性和雄性大白鼠全血提取的DNA為模板的PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。電泳結果顯示以雄性大鼠DNA為模板的PCR產物獲得陽性條帶，以雌性大鼠DNA為模板的PCR產物未見陽性條帶(圖1)，證實提取的DNA具有引物特異性。

圖1 以雌性和雄性大鼠DNA為模板的PCR產物電泳

2.2 實時熒光定量PCR結果

根據Stepone PCR儀實時熒光定量PCR動力學曲線獲Ct值，以樣品起始濃度拷貝數的對數為橫坐標，Ct值為縱坐標，可以得到一條嚴格的直線型標準曲線圖2。

圖2 SRY起始拷貝數定量標準曲線

2.3 嵌合率標準曲線

根據起始拷貝數與樣品稀釋率的一一對應關系，以樣品稀釋率的負對數值為橫坐標，Ct值為縱坐標，可以得到一條嚴格的直線型標準曲線，線性相關系數r＞0.99，檢測最小值達10-3，即0.1%(圖3) 。

圖3 嵌合率定量標準曲線

3 討論

嵌合是指受體在接受異體或異種移植物后，其體內存在著供體細胞，而在移植物內存在著受體細胞。這種供、受體細胞相互移行共存的現象稱為嵌合現象［6］。Bllingham等人于1953年發現了這一現象，提出此現象與獲得性免疫耐受有關。1969年Starzl等對一例接受男性供肝的女性肝移植患者進行細胞分型中發現，男性供肝的所有網狀內皮細胞被女性細胞所代替。隨后，在許多成功的肝、肺、心、腎移植中均發現了嵌合現象［7］。因此Starzl等提出嵌合現象與成功的器官移植有關，嵌合是移植物存活的基礎。PING［8］等證實嵌合可以誘導特異性耐受。

一般來說，應用流式細胞計數儀檢測嵌合體的敏感性為0.5%(即200個受體細胞中檢測出1個供體細胞)，而聚合酶鏈反應(PCR)的方法可在105個細胞中檢測出1個供體細胞。微嵌合體是指在實質器官移植患者的外周組織中，應用PCR方法可檢測，而應用流式細胞計數儀則不能檢測到供體細胞水平［9］。

4 結論

本實驗為實現監測器官移植免耐受狀態的目的，設計了對血細胞嵌合率進行定量檢測的方法。由于實驗模型設計供體采用雄性動物，受體采用雌性動物，因此選用SRY作為檢測指標。SRY基因存在于Y染色體上，其序列具有高度保守性［10］，本實驗中，SRY基因作為標記顯示供體即雄性大白鼠血細胞的存在，檢測指標具有特異性，其拷貝數用來定量。

通過設計的實驗步驟建立的標準品，經實時熒光定量PCR檢測，得到一條準確反映標準品數量關系的標準曲線，線性相關系數r＞0.99，敏感度可達0.1%，符合技術要求。標準曲線的建立證明本實驗程序標準可靠，而且有動物模型顯示1%的供體血細胞嵌合率足以誘導有效的供體特異性耐受［11］。因此，本實驗所建立的標準品及標準曲線可用來對未知樣品進行血細胞嵌合率檢測，可以有效監測器官移植免疫耐受狀態。

［1］ Roozbeh J，Mehdizadeh A R，Izadfar M A，et al.Comparison of spousal with other donor groups：study of a single center［J］.Transplant Proc，2006，38(2)：562-563.

［2］ Sinclair A H，Berta P，Palmer M S，et al.A gene from the human sex-de ter mining region encodes a protein with homology to a conserved DNA-binding motif［J］.Nature，1990，346：240-244.

［3］ Heid C A，Smves J，Livak K J，et al.Real time quantitative PCR［J］.Genome Res.1996.6：986-944.

［4］ 趙洪雯，余榮杰等.大鼠Y染色體探針的制備與鑒定.現代生物醫學進展［J］，2008，8(5)：832-835.

［5］ Higuchi R，Dollinger G，walsh P S，et al.Stimutaneous amplification and detection of specific DNA Sequences［J］.Biotechnology.1992，10：413-417.

［6］ Starzl T E.Cell migration and chimerism after whole-organ transplantation：the basis of graft acceptance［J］.Hepatology.1993.17(6)：1127-1152.

［7］ Reinsmoen N L，Jackson A，McSherry C，et al.Organ-specific patterns of donor antigen-specific hyporeactivity and peripheral blood allogeneic microchimerism in lung，kidney，and liver transplant recipients［J］.Transplantation，1995，60(12).

［8］ Ping Y，SI D X，Qiu Z H，et al.Induction of allogeneic mixed chimerism by immature dendritic cells and bone marrow transplantation leads to prolonged tolerance to major histocompatibilitycomplex disparate allografts［J］.Immunology，2009，127(4)，500-511.

［9］ 陶紹富，李濟宇.嵌合誘導移植耐受的研究進展［J］.廣東醫學，2011，32(2)：250-252.

［10］ Sundaresan S，Trulock E P，Mohanakumar T，et al.Prevalence and outcime of bronchiolitis obliterans syndrome after lung transplantation.Washington University Lung Transplant Group［J］.Ann Thorac Surg，1995，60(5).

［11］ Ildstad S T，Wren S M，Bluestone J A，et al.Effect of selectivel cell depletion of host and/or donor bone marrow on lymphopoietic repopulation，tolrance，and graft-vs-host disease in mixed allogenetic chimeras(B10+B10.D2-B10)［J］.J Immu nol，1986，136：28-33.