茴香霉素產生菌的誘變育種及碳氮源優化

胡申才，柳雪艷，高土玲

(武漢工業學院生物與制藥工程學院，湖北武漢430023)

茴香霉素(Anisomycin)，也稱為殺鞭毛菌素(flagecidin)或異霉素，是由Streptomyces griseolus等鏈霉菌所產生的一種吡咯類次級代謝產物［1］。它具有很好的抗原蟲［2］、抗腫瘤［3，4］和抗真菌作用［5］。

目前科研人員主要嘗試采用化學合成方式來進行anisomycin的生產［6］，但由于該抗生素具有3個手性碳原子和1個手性氮原子，不易合成，且合成產物中往往包含多種不同手性分子，給后續的分離純化造成很大困難，因此該生產方法很不經濟，且化學合成的條件比較劇烈，生產工藝難以符合綠色環保要求。根據研究報道，有Streptomyces griseus等多株鏈霉菌可以產生該抗生素［1，7］，因此尋求微生物發酵法來進行綠色生產不失為一種值得研究開發的生產方式，但原始菌株發酵效價低成為限制其有效生產的一大瓶頸，因此如何提高產生菌的產素能力無疑成為了一個重要研究課題。由此，本文對自主分離篩選獲得的產茴香霉素的鏈霉菌菌株060524進行了菌種選育和發酵條件優化。

1 實驗材料與方法

1.1 菌種

茴香霉素產生菌：鏈霉菌 060524［8］。

生物活性檢定菌：白色念珠菌Candida albicans ATCC 11651。

1.2 培養基及培養條件

(1)種子及初始發酵培養基和培養條件依據文獻［9］進行。

(2)產孢培養基選用SC培養基：可溶性淀粉10.0 g，干酪素 0.3 g，KNO32.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCO30.02 g，FeSO40.01 g，陳海水 750 mL，蒸餾水 250 mL， 瓊脂20 g，pH 7.2-7.4。

1.3 誘變育種方法

1.3.1 孢子的誘變處理

(1)紫外線(UV)誘變：分別取10 mL單孢子懸浮液于3個帶磁棒的φ 90 cm培養皿中，通過磁力攪拌作用紫外燈(25 W，254 nm)下距離25.0 cm照射，分別取樣用無菌水稀釋涂抗性平板，28℃培養5 d。

(2)氯化鋰化學誘變：吸取制備好的孢子懸液0.1mL，分別涂布于含不同濃度氯化鋰分離平板上，28℃培養5 d。

(3)紫外線與氯化鋰復合誘變：取5 mL上述孢子懸液加入平皿，在20W紫外燈下(距離25cm)照射10，20，30，40，50 s和 60 s，各吸取 0.1 mL 涂布于含0.6%的氯化鋰分離平板上，28℃培養5 d。然后用無菌水稀釋涂抗性平板。

上述誘變的同時將未經誘變的孢子懸液用無菌水稀釋涂平板作對照。

1.3.2 突變株的篩選分離

(1)抗性平板的選擇。根據茴香霉素生物合成途徑，茴香霉素合成所需的前體包括酪氨酸(Tyr)、甲硫氨酸、甘氨酸和乙酸鈉等參與了茴香霉素的生物合成等［10］。選擇 Tyr和乙酸鹽作為耐前體突變株的篩選物。

(2)核糖體功能發生改變的突變株的獲得。主要是通過簡便易行的鏈霉素(Str)或氯霉素(Cm)抗生素抗性篩選來獲取核糖體功能發生改變的突變株，從而達到選育菌種的目的，這一技術也被稱為核糖體工程技術。日本國家食品研究所的 Kozo Ochi發現，微生物對抗生素的抗性突變誘導了核糖體的某些特殊蛋白的突變，進而改變其次生代謝產物的生物合成調控系統，使其過量合成某些抗生素［11］，因此可用于提高抗生素產生菌的生產效價，如胡海峰等利用該技術使天藍色鏈霉菌的放線菌紫紅素的產量提高了48 倍［12］。

1.3.3 誘變育種生物活性篩選方法

以白色念珠菌作為茴香霉素生物檢定菌，采用濾紙片擴散法進行初篩。復篩采用搖瓶發酵后高效液相色譜(HPLC)法。

1.4 突變株的茴香霉素產量測定法

茴香霉素產量測定方法如下［13］：

茴香霉素產量測定采用HPLC分析法，色譜條件為：色譜柱(Dikma C 200 ×4.6mm，5 μm)，流動相為甲醇∶水 =40∶60，流速：0.7 mL/min，檢測波長：225 nm，柱溫：室溫，進樣量：l0 μL。

1.5 高產突變株產素能力的遺傳穩定性考察研究

將分離劃線培養好的突變株單菌落連續劃線轉代培養10代，從各代刮取孢子接種制備種子液，再按5% 接種量分別接種于液體黃豆粉發酵培養基，3次重復，28 ℃，200 r/min發酵 5 d，離心，取上清，經0.22 μm微孔濾膜過濾后用所得濾液測定含量。

2 結果與分析

2.1 茴香霉素產生菌的菌種選育

茴香霉素產生菌的菌株誘變技術路線見圖1，以鏈霉菌060524為出發菌株，經物理、化學等因素誘變，最終選育出菌株UL3-85，其茴香霉素生產能力達208.2 mg/L。通過物理和化學誘變因子交叉誘變后，再結合氯霉素或鏈霉素、酪氨酸和乙酸鈉等抗性平板進行篩選，使得篩選更加方便、快捷和靈敏，極大的簡化了工作量和提高了工作效率。

圖1 茴香霉素高產菌UL3-85的誘變育種技術路線圖

2.2 高產突變株UL3-15遺傳穩定性試驗

對篩選的高產菌株UL3-15，經過10代斜面傳代，發酵菌種遺傳性能穩定，產量下降的幅度在5%以內，可用于進一步的發酵研究和基因組重排育種。

2.3 不同碳、氮源對茴香霉素發酵水平的影響

不同的碳、氮源對抗生素的發酵生產會產生顯著性的影響，因此本研究考察了其它營養成分相同條件下分別添加25 g/L的不同碳源或15 g/L的不同氮源對茴香霉素合成的影響，結果見圖2和圖3。由圖2可知，淀粉作為碳源，茴香霉素的產量最高，因此是以后發酵過程中可優先考慮使用的碳源。由圖3可知，除黃豆餅粉外，含其余氮源的發酵培養基中茴香霉素質量濃度很低。

圖2 不同碳源對茴香霉毒產量的影響

圖3 不同氮源對茴香霉素產量的影響

［1］ Sobin B A and Tanner F W.Anisomycin，a new antiprotozoa antibiotic ［J］.J Am Chem Soc.1954，76(15)：4053-4056.

［2］ Lynch J E，English A R，Bauck H，et al.Studies on the in vitro activity of amisomycin［J］.Antibiot Chemotherapy.1954，4：844-848.

［3］ Hosoya Y，Kameyama T，Naganawa H，et al.Anisomycin and new congeners active against human tumor cell lines［J］.J Antibiot.1993，46(8)：1300-1302.

［4］ 胡申才.具細胞毒活性海洋微生物的分離篩選及次級代謝物的研究［D］.武漢：華中農業大學，2005：98-127.

［5］ 仝贊華，王學士.農抗120中組份A’對幾種作物病原真菌抑菌活性的研究［J］.中國生物防治，1995，11(3)：106-110.

［6］ Hulme A N，Rosser E M.An aldol-based approach to the synthesis of the antibiotic anisomycin［J］.Org Lett，2002，4(2)：265-267.

［7］ Yoshiko H，Toshiyuki K，Hiroshi N，et al..Anisomycin and new congeners active against human tumor cell lines［J］.The Journal of Antibiotics.1993，46(8)：1300-1302.

［8］ 胡申才.具細胞毒活性海洋微生物的分離篩選及次級代謝物的研究［D］.武漢：華中農業大學，2005.

［9］ 胡申才，譚仁祥，莊令，等.獲自鏈霉菌060524發酵液細胞毒活性物質［J］.中國抗生素雜志.2009，34(3)：S1-S3

［10］ Butler K.Anisomycin.II.Biosynthesis of Anisomycin［J］.J Org Chem，1966，31(1)：317-320.

［11］ Wang G.J，Hosaka T，Ochi K.Dramatic activation of antibiotic production in Streptomyces coelicolor by cumulative drugresistance mutations ［J］. Appl Environ Microbiol.2008，74(9)：2834-2840.

［12］ Hu H F，Zhang Q，Ochi K.Activation of antibiotic biosynthesis by specified mutations in the rpo Bgene(encodingthe RNA polymerase β subunit) of Streptomyces lividans ［J］.J Bacteriol.2002，184(14)：3984-3991.

［13］ 黃婷嬌，倪現樸，夏煥章.梧寧霉素C組分高產突變株的獲得和產物初步鑒定［J］.中國抗生素雜志.2011，36(2)：121-124.