高效液相色譜法測(cè)定武夷橙中的有機(jī)酸

（武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300）

前言

武夷橙是繼“武夷巖茶”之后又一個(gè)以“武夷”命名的名果，它是經(jīng)科技人員辛勤培育的，適宜武夷山種植的一種新橙種。武夷橙含橙皮甙、檸檬酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、果糖、果膠和大量維生素（C、P）等營(yíng)養(yǎng)物，增加毛細(xì)血管的彈性，其中以檸檬酸含量最高，檸檬酸具有顯著的保健效果，它不僅能有效促進(jìn)體內(nèi)乳酸分解，解除疲勞，改善精神狀態(tài)，而且能增進(jìn)食欲，保護(hù)肝臟和腎臟，具有防治疾病和延緩衰老等諸多功效。

有機(jī)酸測(cè)定的傳統(tǒng)化學(xué)法容易受干擾、誤差大、且每次只能測(cè)定一種有機(jī)酸。薄層色譜法定量精度差；氣相色譜法往往需要衍生步驟，不僅煩瑣、而且影響分析結(jié)果。高效液相色譜測(cè)定方法簡(jiǎn)便，特別是對(duì)于芳香族有機(jī)酸和多元酸，已被廣泛用于各種食品及天然物中有機(jī)酸的測(cè)定[1-3]。本實(shí)驗(yàn)研究采用反相高效液相色譜法，對(duì)武夷橙中多種有機(jī)酸進(jìn)行分析測(cè)定，取得較好的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

高壓液相色譜系統(tǒng)（HPLC）是由Hitachi L-2000輸液泵，Hitachi L-2400紫外檢測(cè)器，Rheodyne 7725六通閥進(jìn)樣器，T2000色譜工作站組成；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器；組織粉碎機(jī)；800型低速離心機(jī)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空抽濾機(jī)；W201B恒溫水浴鍋；S2-Ⅱ型自動(dòng)雙重純水蒸餾器。

標(biāo)準(zhǔn)品草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸均為分析純；樣品為剛采摘下的武夷橙；磷酸二氫銨，無(wú)水乙醇和磷酸都為分析純；水是三次重蒸水。

1.2 樣品萃取

將新鮮武夷橙清洗后去皮，放入組織粉碎機(jī)中粉碎，出汁。取5g橙汁在水浴75℃下蒸干后，加入80%的無(wú)水乙醇5mL，使底物完全溶解，然后在7200r/min下離心15min，取上清液再次蒸干后，加入2.5%磷酸二氫銨5mL溶解，再次離心15min，最后用磷酸二氫銨定容至10mL，真空抽濾后完成樣品萃取。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取草酸5mg、酒石酸50mg、蘋(píng)果酸150mg、乳酸200mg、檸檬酸120mg、乙酸200mg及琥珀酸180mg標(biāo)準(zhǔn)品，用三次蒸餾水配制成一系列濃度為0.1、1、3、4、2.4、4、3.6mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸混合溶液。

1.4 色譜分離條件

色譜柱：C18 柱（150mm×4.6mm i.d.,5μm）；流動(dòng)相：2.5%磷酸二氫銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH為2.5），使用前經(jīng)0.45μm濾膜減壓過(guò)濾；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；標(biāo)準(zhǔn)及樣品用前均經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾。

1.5 分析測(cè)定方法

分別取有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合液 1，2，4，6，8，10μL 進(jìn)樣進(jìn)行色譜分析，得出有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。以各有機(jī)酸的峰面積為縱坐標(biāo)，有機(jī)酸的含量(μg)橫坐標(biāo)分別繪制各有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法原理建立各有機(jī)酸的回歸方程。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相選擇

有機(jī)酸為弱酸，在水系流動(dòng)相中易解離，故采用離子抑制方法，使其在非極性固定相上保留而得到分離。有機(jī)酸的紫外吸收大多在210 mm左右，磷酸二氫銨緩沖溶液在紫外區(qū)幾乎無(wú)吸收，作為測(cè)定有機(jī)酸的流動(dòng)相可改善有機(jī)酸的分離而不影響檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用2.5%磷酸二氫銨緩沖溶液作為流動(dòng)相。

2.2 緩沖溶液PH值確定

因?yàn)橛袡C(jī)酸在水中以RCOOH和RCOO-兩種形式存在,PH值越小，酸以RCOOH形式存在。如果用RP-HPLC對(duì)有機(jī)酸分析時(shí)，希望被分析的物質(zhì)在流動(dòng)相中以RCOOH形式存在，并要求半峰寬小，峰形對(duì)稱，分離效果好。可以通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的PH值來(lái)實(shí)現(xiàn)，但不能低于普通反相色譜柱可耐受的PH值[4]。因此本實(shí)驗(yàn)將流動(dòng)相的PH值確定控制在2.5。

2.3 柱溫的選擇

有機(jī)酸的保留，隨柱溫升高而減小，乙酸和乳酸的分離對(duì)溫度變化很敏感。當(dāng)溫度超過(guò)20℃時(shí)，兩者很難分開(kāi)。本實(shí)驗(yàn)選擇柱溫為17℃。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

將有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述色譜條件下進(jìn)行，以面積外標(biāo)法定量，得到7種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，如圖1所示：

2.5 線性范圍考察和標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

準(zhǔn)確配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸混合溶液，分別進(jìn)樣作色譜分析，測(cè)定其峰面積，以峰面積y對(duì)質(zhì)量濃度x（μg/L）作圖可知，y與x呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表1。

表1 、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table1 Theregression equations and correlation coefficient

2.6 樣品含量測(cè)定

取處理樣品，稀釋至原濃度的1/40，進(jìn)樣10μL，在所選色譜條件下進(jìn)行HPLC測(cè)定，其樣品色譜圖如圖2，有機(jī)酸含量如表2。

表2 、武夷橙中有機(jī)酸的含量Table2 Determination resultsof someorganic acidsin WUYIOrange

由表2可知：武夷橙果肉中檸檬酸含量最高，占有機(jī)酸總量的52%以上。檸檬酸具有顯著的保健效果，它不僅能有效促進(jìn)體內(nèi)乳酸分解，解除疲勞，改善精神狀態(tài)，而且能增進(jìn)食欲，保護(hù)肝臟和腎臟，具有防治疾病和延緩衰老等諸多功效[5]。可以預(yù)料，深度開(kāi)發(fā)武夷橙及其產(chǎn)品將帶來(lái)明顯的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

2.7 回收率及精密度試驗(yàn)

取處理樣品，分別加入一定量的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行HPLC分析，每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，作加樣回收率實(shí)驗(yàn)，測(cè)得7種有機(jī)酸的平均回收率為98%～110% ，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為 2.26% ～3.79% 。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。

表3 、回收率測(cè)定結(jié)果Table3 Determination results of recovery

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，采用HPLC測(cè)定武夷橙中有機(jī)酸的含量，樣品制備簡(jiǎn)便，分離效果好。武夷橙有機(jī)酸組分在C18柱上得到了基線分離，且具有良好的線性關(guān)系，方法的精密度和回收率都很高,速度快，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。此方法的建立，為武夷橙及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的分析測(cè)定提供參考。

[1] 丁明玉，陳培榕，羅國(guó)安.食品中有機(jī)酸的高效液相色譜分析法[J].色譜，1997，15(3)：212～215.

[2] 于世林.高效液相色譜法及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

[3] 朱明華.儀器分析(第3版)[M].北京：高等教育出版社，2000.

[4] 趙景嬋.有機(jī)酸類化合物的反相高效液相色譜的分離條件研究[J].色譜，2001，19(3)：260～262.

[5] 李友元，陳長(zhǎng)華，陶萍.高效液相色譜測(cè)定螺旋霉素發(fā)酵液中的有機(jī)酸[J].色譜，2002，20(1)：46～48.