竹葉黃酮和竹葉多糖清除亞硝酸鹽的作用

（武夷學院 生態與資源工程系——福建省高校綠色化工技術重點實驗室，福建 武夷山354300）

竹葉在我國有著悠久的食用和藥用歷史，其性淡、微澀、寒、味甘，具有清熱利尿、明目解毒、止血、免疫調節、抗氧化、抗艾滋病和抑制腫瘤等功效，且無毒無害，可作為綠色食品進行開發。竹葉黃酮和多糖在竹葉中的含量豐富，具有多種藥理和保健作用[1-4]。目前對竹葉的研究主要集中在竹葉提取物、竹葉黃酮、竹葉多糖抗氧化、清除自由基方面，而對于竹葉黃酮和多糖清除亞硝酸鹽的作用報道很少。閩北是中國竹子之鄉，但目前對竹葉的利用十分有限，大部分被廢棄物處理，未能得到充分的利用。本試驗從竹葉中提取黃酮和多糖，測定了它們清除亞硝酸鹽的作用，并同Vc進行比較，結果如下。

1 材料與方法

1.1 儀器：MAPADA分光光度計、索氏脂肪提取器、旋轉攪拌儀、超聲洗滌器、旋轉蒸發儀、湘儀H-2050R高速離心機等。

1.2 試劑：石油醚（沸程 30～60℃）、無水乙醇、鹽酸、冰乙酸、氫氧化鈉、蘆丁、硝酸鋁，葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸試劑、亞硝酸鈉、氯化銨、無水對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、以上試劑均為AR，試驗用水均為二次蒸餾水。

1.3 蘆丁標準曲線的繪制：

取25 mL刻度試管支，按下表加試劑：

蘆丁標準液（0.2mg/mL）(mL) 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 5%亞硝酸鈉(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 10%硝酸鋁(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 4%氫氧化鈉(mL) 10.0 10.0 10.010.0 10.0 10.0 10.0

蒸餾水加至25mL搖勻，放置6分鐘，以1cm比色皿、1號管調零、500nm測吸光度，繪制標準曲線。

1.4 葡萄糖標準曲線繪制：取25刻度試管7支，按下表加液：

葡萄糖標準液（1mg/mL） 0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0重蒸水（mL） 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.0 0 3,5-二硝基水楊酸試劑（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

混勻，在沸水中加熱5分鐘，取出，立即用冷水冷卻至室溫，再向每管加重蒸水20mL混勻，用1號管調零，520nm測吸光度，繪制標準曲線。

1.5 亞硝酸鹽標準曲線繪制：在25ml具塞比色管按下表加液：

亞硝酸鈉標準應用液（10.0μg/mL）（mL） 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5相當于亞硝酸鈉（μg） 0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0氯化銨緩沖液（mL） 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 60% 乙酸（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 0.4%對氨基苯磺酸(mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0混勻，靜置 3～5min 0.1%鹽酸萘乙二胺（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

重蒸水加至25mL，混勻，靜置5min，用1cm比色杯、1號管調零，538nm測定吸光度，繪制標準曲線。

1.6 竹葉黃酮和多糖的提取：竹葉采自武夷學院內，先用蒸餾水洗滌、80℃烘干、粉碎、過40目篩。將竹葉粉末置于索氏脂肪提取器，用石油醚回流去除脂肪、色素后用 80%乙醇為溶劑、固液比 1∶10、60℃攪拌45min，再以30℃超聲輔助5min的條件提取黃酮，提取液用旋轉蒸發儀濃縮至適量后以蘆丁為標準測定黃酮含量，直接用于實驗。將提取黃酮后的竹葉殘渣烘干，用10倍體積的蒸餾水、80℃、攪拌45min，再以30℃、250W超聲輔助5min的條件提取多糖，提取液用旋轉蒸發儀減壓濃縮至適量后以10%的三氯乙酸調pH至3.0沉淀蛋白質，離心除蛋白后的多糖濃縮液80℃左右烘干水份得竹葉多糖粗品。精確稱取烘干的竹葉多糖粗品100mg，用蒸餾水溶解定容至100mL，過濾后用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖、總糖，計算多糖的含量和純度。

1.7 清除亞硝酸鹽的測定方法：在標準管中加入20μg的亞硝酸鈉標準液；在樣品空白管和樣品測定管中分別加入0.10～5.00（mL）1mg/mL濃度的竹葉黃酮、竹葉多糖、Vc，樣品測定各平行3管，各管再加入20μg的亞硝酸鹽標準液，混勻，靜置反應5min后同標準曲線測定加入其余試劑后比色。樣品對亞硝酸鹽的清除率 （%）=[標準管吸光度－（樣品測定管吸光度－樣品空白管吸光度）]÷標準管的吸光度×100

1.8 數據統計處理：標準曲線計算回歸方程和相關系數；測定結果列出n，X±S，組間差異以t檢驗或方差分析，SSR法多重比較。

2 結果

2.1 竹葉黃酮的提取率為0.83%，竹葉多糖的提取率為1.15%，竹葉多糖的純度為83.3%。

2.2 蘆丁、葡萄糖、亞硝酸鹽標準曲線的測定結果見表1。

表1 .蘆丁、葡萄糖、亞硝酸鹽標準曲線的測定結果

2.3 不同劑量Vc、竹葉黃酮和竹葉多糖清除亞硝酸鹽的結果見表2、圖1。

表2 .不同劑量Vc、竹葉黃酮和竹葉多糖對亞硝酸鹽的清除率（%，n，X±S）

3 分析與討論

3.1 由表2和圖1測定結果見，竹葉黃酮對亞硝酸鹽有較強的清除率，劑量從0.1mg增加到4.0mg，清除率從15.72%增加到84.59%，劑量和作用之間基本呈線性關系（r=0.9649）；劑量再增加到5.0 mg，清除率不再顯著增加（P＞0.5）。竹葉多糖對亞硝酸鹽也有一定的清除率，劑量從0.1mg增加到3.0mg，清除率從8.55%增加到36.10%，劑量和作用之間也呈線性關系 （r=0.9789）；劑量再增加到4.0mg和5.0mg，清除率并不繼續增加（P＞0.4）。

3.2 Vc在體外對亞硝酸鹽的清除率相當高，0.1mg劑量的清除率即達到61.24%，劑量增加到1.0mL時清除率已達到100%，故實驗中Vc劑量不需再增加；清除率隨劑量增加的曲線似拋物線形，（r=0.8678）；而且Vc對亞硝酸鹽的清除率均顯著高于同劑量的桂花黃酮和多糖（均 P＜0.01或 0.001）。

3.3 N-亞硝基化合物是一種致癌性很強的化合物，至今已經研究的近300種N-亞硝基化合物中，約90%以上具有致癌性，并證明N-亞硝基化合物可在體內外由其前體物胺類與硝酸鹽或亞硝酸鹽形成。正常情況下,人們直接從食物中攝入的亞硝胺和亞硝酰胺極少,但形成它們的前體物亞硝酸鹽卻大量存在于食物中,特別是亞硝酸鹽在人和動物的胃中更適宜合成亞硝胺。因此，清除體內亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的合成是預防癌癥的有效途徑[5、6]。

許多學者研究了從天然植物中提取的黃酮類物質對亞硝化反應的抑制作用，認為阻斷原理是：在模擬人體胃液的條件下，二甲胺與亞硝酸鈉在37℃條件下，可適宜地生成二甲基亞硝胺，當往黃酮提取液中依次加入二甲胺與亞硝酸鈉時，黃酮類物質優先同亞硝酸鈉作用，使二甲胺不能與亞硝酸鈉反應，達到阻止亞硝胺生成的目的[7]。

3.4 一些資料報道了竹葉黃酮清除亞硝酸鹽的作用；據許剛等報道，竹葉的甲醇、乙醇、丙酮提取物濃度在0～146.3mg/mL時，對N-亞硝胺合成的阻斷率在0～92.86%；濃度0～97.54mg/mL時，對亞硝酸鹽的清除率在 0～90.07% （此時清除亞硝酸鹽約 100μg）[8]。據樓鼎鼎等報道，肉制品中添加竹葉抗氧化物(AOB，其中總黃酮含量32.3%），可減少產品中亞硝酸鹽的殘留量，當AOB的添加量（以總黃酮計）為0.003%時，亞硝酸鹽含量比對照降低16%；當AOB添加量0.01%時,則降低20%以上；說明AOB具有一定的清除亞硝酸鹽的能力[9]。據吳洪報道，竹葉黃酮濃度從2.309增加到115.45（mg/mL），對亞硝酸鹽的清除率從9.84%增加到89.32%[10]。吳洪等還從18種中藥中提取黃酮，測定對亞硝酸鹽的清除率，作用較好的是化橘紅、橘皮、竹葉，黃芩、金錢草、甘草、桑白皮、桑椹黃酮類，對亞硝酸鹽的清除率最大分別可達到93.16%、89.49%、89.32% 、80.82% 。77.37% 、75.07% 、69.71% 、67.85%[11]，竹葉黃酮的最大清除率與本實驗結果基本一致。

3.5 許多植物多糖具有清除亞硝酸鹽的作用，據李碧嬋等報道，紅菇多糖劑量從0.125mg/mL增至0.375mg/mL，對亞硝酸鹽的清除率從15.72%顯著增加到45.3%，再增加多糖劑量時清除率反而下降[12]。據馮翠萍等報道，靈芝孢子粉多糖從1.2增加到2.5（mg/mL）對亞硝酸鹽的清除率從82.4%增加到88.3%[13]。據郭豫梅報道，0.164mg/mL的石參多糖對亞硝酸鹽的清除率為37.56%[14]。據李利華等報道，120.5mg的魚腥草多糖對15μg亞硝酸鹽的清除率達到64.37%[15]。據但飛君等報道，紅毛七多糖對多糖濃度為4.0mg/mL時,對的清除率達85.1%[16]。據王曉梅等報道，朱砂七多糖濃度為5mg/ml時,對亞硝胺合成的阻斷率為41.27%；濃度為0.09mg/ml時，對亞硝酸鹽的清除率最高，為67.03%[17]。據郭小鵬等報道，向25mL模擬胃液中加入50mg黃參多糖，反應15min，對亞硝酸鹽清除率可達86.6%[18]。據李志英等報道，加入β-環糊精能使黃芪多糖對亞硝酸鹽的清除能力從29.1%提高到50.2%[19]。據張庭廷等報道，0.25mg 和 0.5mg 的枸杞多糖、金櫻子多糖、茶多糖對20μg亞硝酸鹽的清除率分別為 53.36% 和 99.72% 、48.29% 和 88.97% 、50.27% 和91.45%[20]。關于竹葉多糖清除亞硝酸鹽，目前尚未見報道，本文首次報道竹葉多糖清除亞硝酸鹽的作用，但清除率顯著小于竹葉黃酮和 Vc（均 P＜0.01或0.001），也小于大部分植物多糖對亞硝酸鹽的清除率。

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