涎腺非霍奇金淋巴瘤相關基因表達及意義

蔡杰，張品南，郭群

（1.溫州醫學院 仁濟學院，浙江 溫州 325035；2.溫州市第三人民醫院 病理科，浙江 溫州325000）

涎腺非霍奇金淋巴瘤相關基因表達及意義

蔡杰1，張品南2，郭群2

（1.溫州醫學院 仁濟學院，浙江 溫州 325035；2.溫州市第三人民醫院 病理科，浙江 溫州325000）

目的：分析涎腺非霍奇金淋巴瘤的臨床病理特點，探討其分子遺傳學特征及意義。方法：依據2008年WHO腫瘤分類標準對標本重新診斷核實。采用IgH、MALT1、bcl-6、c-myc、bcl-2、CCND1、bcl-10、FOXP1雙色分離重排探針、IgH/bcl-2雙色融合易位探針和18號染色體著絲粒探針，利用間期螢光原位雜交（FISH）的方法檢測32例涎腺非霍奇金淋巴瘤的分子遺傳學特點。結果：32例淋巴瘤中黏膜相關淋巴組織結外邊緣區B細胞淋巴瘤（MALT淋巴瘤）28例（占87.5%），濾泡性淋巴瘤2例，彌漫性大B細胞淋巴瘤2例。60.7%（17/28)的涎腺MALT淋巴瘤攜帶分子遺傳學異常。其中IgH基因斷裂1例，但未找到與其發生相互易位的伙伴基因；基因3拷貝者16例，其中MALT1基因、bcl-6基因和c-myc基因3拷貝的發生率分別為25%（7/28)、43%（12/28）和7%（2/28）。16例基因3拷貝病例中，兩種基因3拷貝合并存在者5例，其中bcl-6基因合并MALT1基因3拷貝者4例，bcl-6基因合并c-myc基因3拷貝者1例。進一步研究顯示，MALT1基因3拷貝者均存在18號染色體三體。2例濾泡性淋巴瘤都攜帶t（14；18）（q32；q21)/IgH-bcl-2。2例彌漫性大B細胞性淋巴瘤均存在遺傳異常，1例表現為bcl-6基因3拷貝合并18號染色體三體，另1例表現為bcl-6基因3拷貝合并IgH和c-myc基因雙斷裂。結論：MALT淋巴瘤是涎腺常見的淋巴瘤類型；間期FISH有助于淋巴瘤的分類；MALT1基因3拷貝者由18號染色體三體所致；18號染色體三體和bcl-6基因3拷貝（可能為3號染色體三體所致）是涎腺MALT淋巴瘤常見的分子遺傳學異常。

涎腺腫瘤；淋巴瘤；原位雜交；免疫組織化學

原發于涎腺區域的淋巴瘤少見[1]。這主要是因為正常涎腺組織中無淋巴細胞參與組成，只是在發生涎腺的自身免疫性疾病（如原發或繼發Sjogren綜合征有關的肌上皮性涎腺或淋巴上皮性涎腺炎）時，其涎腺導管周圍出現淋巴組織的基礎上淋巴細胞克隆性增生形成腫瘤。原發于涎腺的淋巴瘤通常有4個主要類型，即黏膜相關淋巴組織結外邊緣區B細胞淋巴瘤（extranodal marginal zone B-cell lymphoma of mucosa massociated lymphoid tissue，MALT淋巴瘤）、淋巴漿細胞淋巴瘤（lymphoplasmacytic lymphoma，LPL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)、濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL），其中以MALT淋巴瘤最常見。淋巴瘤的確切診斷和準確分型對其治療和預后的判斷甚為關鍵。WHO腫瘤分類及診斷標準明確指出，淋巴瘤的診斷和分型需要結合臨床特征、形態學改變、免疫表型及分子遺傳學改變4個方面的資料進行綜合判斷。分子遺傳學改變不僅有助于疾病的診斷和分型，其在指導治療、預后評估和揭示發生機制等方面也具有重要意義。目前國內關于涎腺淋巴瘤的研究主要集中于臨床病理學，而分子遺傳學的研究報道較少[2-3]。我們收集32例涎腺淋巴瘤組織標本，分析其臨床病理特征，并探討其分子遺傳學特點及其意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集溫州醫學院附屬第一醫院和溫州市第三人民醫院1990-2010年涎腺區域原發性涎腺淋巴瘤32例，其中發生于腮腺26例，頜下腺4例，舌下腺2例。男27例，女5例，平均年齡53.70歲。均以局部漸進性增大的無痛性腫塊為首發癥狀而就診，僅5例伴發熱，3例伴全身（2處以上）其他部位淺表淋巴結腫大，多為雙腮腺區、雙頜下或單側腮腺（頜下）及頸部淋巴結腫大。本組32例均行手術后加化療。2例DLBCL患者因腦出血和繼發感染分別于術后3個月和1.5年死亡。存活30例中，大于10年和5年分別為25例和5例，現仍續訪。所有腫瘤標本均經4%甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，HE染色，光鏡觀察，并經兩位經驗豐富的病理醫師參照文獻及WHO標準[4]進行診斷分類。

1.2 免疫組織化學染色 采用EnVision法，DAB顯色，陽性信號為棕黃色顆粒。選用CD20、CD79a、CD3、CD45RO、AE1/AE3、CD5、CD23、CD10、cyclinD1抗體。二抗為鼠、兔通用試劑（均購自丹麥DaKo公司）。每組病例均設立陽性對照及陰性對照（為已知的相應標記物陰性或陽性的淋巴瘤組織），并以TBS代替一抗作空白對照。

1.3 間期熒光原位雜交（FISH） 所用探針為IgH、MALT1、c-myc、bcl-6、bcl-2、CCND1、bcl-10、FOXP1雙色分離重排探針、IgH/bcl-2雙色融合易位探針和橙色18號染色體著絲粒探針。所有探針均購自美國Vysis/Abbort公司。其操作以4～5 um厚的石蠟切片常規脫蠟，水化后按文獻[5]步驟操作完成。結果判定：雙色分離重排探針制劑均含有以綠色和橙色熒光素標記的兩個探針，其分別與所檢測靶基因的兩端（telomeric和centromeric）雜交，在相應雙色濾光片下觀察，正常間期細胞核中存在橙色和綠色融合而成的兩個黃色融合信號；當相應基因出現斷裂時（如與另一染色體上的基因發生易位）間期細胞核中出現一個黃色的信號、一個單獨的橙色和一個單獨的綠色信號；當所檢測靶基因出現拷貝數增多時，細胞核內出現多于2個的黃色融合信號。IgH/bcl-2雙色融合重排探針以綠色標記整個IgH基因，以橙色標記整個bcl-2基因，正常情況下，細胞核中出現兩個單獨的橙色信號和兩個單獨的綠色信號；當存在t（14；18）（q32；q21）染色體易位時，細胞核中出現陽性信號，典型類型一個黃色的融合信號、一個單獨的橙色和一個單獨的綠色信號。18號染色體著絲粒探針以橙色標記整個著絲粒，正常情況下，在細胞核中顯示兩個橙色信號；當存在18號染色體數量異常時，細胞核中則顯示相應數量的橙色信號。每例計數至少100個帶有完整信號的間期細胞核。本組研究正常細胞出現假陽性信號的頻率為：IgH（3.0±1.0）%、MALT1（1.0±0.3）%、bcl-6（1.0±0.6）%、c-myc（3.0±1.6）%、bcl-2（2.0±0.3）%、CCND1（1.0±0.3）%、IgH/bcl-2（1.0±0.5)%，及CEP18（1.0±0.2）%。

2 結果

2.1 分類 32例淋巴瘤均為B細胞非霍奇金淋巴瘤，其中MALT淋巴瘤28例（占87.5%），FL 2例，DLBCL 2例。

2.2 形態學、免疫組織化學表型 病變由單一、彌漫腫瘤細胞組成（見圖1），瘤細胞均呈現CD20膜陽性（見圖2）、CD79a胞質陽性，T細胞抗原CD3、CD45RO染色呈陰性。其中2例DLBCL鏡下病變由彌漫增生的大細胞組成（見圖3），細胞直徑為小淋巴細胞的2倍或2倍以上，免疫表型為CD79a膜陽性（見圖4）、CD10（-）、bcl-6（+）、Mum-1（-）、Ki-67為50%～60%。28例MALT淋巴瘤CD5、CD10、CD23、cyclinD1均陰性。2例FL CD5、CD23、cyclinD1陰性，CD10和bcl-2陽性。

圖1 涎腺MALT淋巴瘤形態學改變，病變由單一、彌漫腫瘤細胞組成（HE，×100）

圖2 涎腺MALT淋巴瘤病變CD20抗原表達呈CD20膜陽性（EnVision法，×200）

圖3 涎腺DLBCL形態學改變，病變由單一、彌漫大B細胞組成（HE，×200）

圖4 涎腺DLBCL病變CD79a抗原表達呈現膜陽性（EnVision法，×200）

2.3 分子遺傳學改變 利用IgH、MALT1、bcl-6和c-myc雙色分離重排探針所做間期FISH結果顯示，28例MALT淋巴瘤中有1例IgH基因位點出現斷裂（見圖5），其余27例IgH、MALT1、bcl-6和c-myc基因位點均未見斷裂（見圖6）。對IgH基因斷裂的標本，進一步利用bcl-10、FOXP1、bcl-2和CCND1雙色分離重排探針尋找與IgH發生相互易位的伙伴基因，均未發現染色體在以上基因位點斷裂。以上結果表明，28例MALT淋巴瘤中，1例腫瘤細胞存在涉及IgH基因位點的分子遺傳學異常，但與其發生相互易位的伙伴基因不明；與MALT淋巴瘤相關的染色體易位 t（11；18）（q21；q21）、t（14；18）（q32；q21）/IgH-MALT1、t（1；14）（p22；q32）、t（3；14）（p14.1；q32）和涉及bcl-6基因的染色體易位發生率為0；其他淋巴瘤常見染色體易位t（14；18）（q32；q21）/IgH-bcl-2、t（11；14）（q13；q32）和t（8；14）（q24；q32）發生率也為0。28例MALT淋巴瘤中16例可見基因3拷貝（見圖7）。其中MALT1基因、bcl-6基因和c-myc基因3拷貝的發生率分別為25%（7/28）、43%（12/28）和7%（2/28）。16例基因3拷貝病例中，兩種基因3拷貝合并存在者5例，其中bcl-6基因合并MALT1基因3拷貝者4例，bcl-6基因合并c-myc基因3拷貝者1例。進一步采用18號染色體著絲粒探針檢測結果顯示，MALT1基因3拷貝者均存在18號染色體三體，且兩者的熒光信號在數量分布上完全一致。對于FL利用IgH和bcl-2雙色分離重排探針檢測結果顯示，染色體在IgH和bcl-2基因位點均發生了斷裂，且分布一致。進一步使用IgH/bcl-2雙色融合易位探針檢測，可見IgH和bcl-2基因發生了融合，表明2例FL標本均攜帶t（14；18）（q32；q21）/IgH-bcl-2（見圖 8）。對于DLBCL利用IgH、bcl-6、MALT1和c-myc雙色分離重排探針和CEP18著絲粒探針所做間期FISH結果顯示，2例DLBCL標本均bcl-6基因3拷貝，其中1例合并存在18號染色體三體，另1例還可見IgH和cmyc基因雙斷裂，即存在t（18；14）/c-myc-IgH。

圖5 MALT1基因3拷貝；利用MALT1雙色分離重排探針雜交后，腫瘤細胞間期核內由兩個橙色和綠色融合而成的信號（FISH，×1 000）

圖 6t（14；18）（q32；q21）/IgH-bcl-2；利用IgH/bcl-2雙色融合易位探針雜交后，腫瘤細胞的間期核內出現2個橙色和綠色融合而成的信號，1個單獨的綠色信號和一個單獨的橙色信號（FISH，×1000）

圖7 未發現遺傳學改變的間期細胞核；利用bcl-6雙色分離重排探針雜交后，腫瘤細胞間期細胞核內有兩個橙色和綠色融合而成的信號（FISH，×1000）

圖8 IgH基因斷裂；利用IgH雙色分離重排探針雜交后，攜帶IgH染色體易位的腫瘤細胞間期核內出現異常信號（1個橙色和綠色融合信號，1個橙色信號和1個綠色信號）（FISH，×1000）

3 討論

涎腺惡性淋巴瘤少見，其發生與自身免疫和慢性感染密切相關，如舍格倫綜合征和慢性自身免疫性甲狀腺炎以及丙型肝炎病毒、EB病毒、人類嗜T淋巴細胞病毒及人類免疫缺陷病毒感染[6]。淋巴瘤的類型是淋巴瘤的重要預后因素之一。本組32例均為B細胞來源的非霍奇金淋巴瘤，其中MALT淋巴瘤28例，為最常見類型，此外還可見FL和DLBCL。

我們利用間期FISH方法對已確診病例的遺傳學特點進行了研究，結果顯示，65.5%（21/32)的淋巴瘤標本攜帶遺傳學異常，其中MALT淋巴瘤、FL和DLBCL分子遺傳學異常的發生率分別為60.7%、100%和100%，表明利用間期FISH檢測分子遺傳學異常特點是淋巴瘤分類的有益補充。但需要說明的是，雖然在攜帶有分子遺傳學異常的涎腺淋巴瘤中，間期FISH分析的意義是肯定的，但也有部分涎腺淋巴瘤并未檢測到分子遺傳學異常，因此，間期FISH陰性結果不能否定淋巴瘤的診斷。最后的病理診斷還需結合臨床表現、形態學特點、免疫組織化學以及淋巴細胞克隆性分析等結果綜合判斷。

DLBCL的遺傳學特點常常較為復雜，可涉及IgH、bcl-6、bcl-2以及c-myc等基因[7]。間期FISH結果顯示，本組2例DLBCL的腫瘤細胞均攜帶遺傳學異常，其中一例表現為bcl-6基因3拷貝合并18號染色體三體；另一例為bcl-6基因3拷貝合并t（8；14）/c-myc-IgH。c-myc基因是眾所周知的癌基因，它的功能失調促使細胞進入細胞周期，在淋巴瘤特別是伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）的發生中起著重要作用[8]。本組原發性涎腺淋巴瘤標本中，7%的MALT淋巴瘤出現c-myc基因3拷貝，其中1例DLBCL又存在t（8；14）/c-myc-IgH，提示cmyc基因可能參與了涎腺淋巴瘤的發生發展。t（8；14）（q24；q32）遺傳學異常可見于80%～90%的BL和5%～15%的DLBCL病例中，但攜帶該染色體易位是否對DLBCL患者預后有影響尚有爭議。常見的小細胞性B細胞淋巴瘤包括小淋巴細胞性淋巴瘤、FL、套細胞淋巴瘤和MALT淋巴瘤。各型小細胞性B細胞淋巴瘤間僅憑形態學特點常難以鑒別，免疫組織化學的發展大大促進了它們之間的鑒別診斷，但仍有一些病例難以確診。研究表明，90%～95%的FL攜帶有遺傳學異常t（14；18）（q32；q21）/IgH-bcl-2，幾乎所有套細胞性淋巴瘤均存在t（11；14）（q13；q32）/IgH-CCND1，MALT淋巴瘤病例常存在涉及MALT1基因的遺傳學異常，而不存在t（14；18）（q32；q21）/IgH-bcl-2和 t（11；14）[8-9]。本組 30例小細胞性B細胞淋巴瘤結合形態學和免疫標記，2例診斷為FL，其余28例均為MALT淋巴瘤。進一步選用IgH、MALT1、bcl-2雙色分離重排探針和IgH/bcl-2雙色融合易位探針，利用間期FISH方法檢測其遺傳學的特點，結果顯示，2例FL腫瘤細胞均攜帶t（14；18）（q32；q21）/IgH-bcl-2而不存在t（11；14），28例MALT淋巴瘤均未見以上兩種遺傳學異常。表明間期FISH可應用于臨床，作為各類型小細胞性B細胞淋巴瘤診斷和鑒別診斷的重要輔助手段，尤其在免疫組化不理想的情況下其作用更有意義。近年發現MALT淋巴瘤有四組顯著不同的染色體易位類型：t（11；18）（q21；q21）/API2-MALT1、t（1；14）（P22；q32）/IgH-bcl-10、t（14；18）（q32；q21）/IgH-MALT1和t（3；14）（P14.1；q32）/IgHFOXP1，并涉及bcl-6基因的遺傳學異常以及3、12和18號染色體數量的異常，與MALT淋巴瘤有關[9-11]。本組涎腺淋巴瘤中常見染色體易位的發生率為0，1例IgH基因斷裂但未找到與其發生相互易位的伙伴基因，提示涎腺MALT淋巴瘤中可能存在尚未發現的涉及IgH基因的染色體易位。本組病例雖未見MALT1、bc1-6和C-Myc基因位點的斷裂，但有57.1%（16/28）的病例出現基因3拷貝現象，bcl-6、MALT1和c-myc基因3拷貝的發生率分別為43%（12/28）、25%（7/28）和7%(2/28)。為了明確基因3拷貝現象與染色體數目的關系，我們進一步使用了18號染色體著絲粒探針對MALT1基因3拷貝全部病例進行檢測。結果顯示，MALT1基因3拷貝和18號染色體三體的細胞無論在數量還是分布上都完全一致，提示MALT1基因3拷貝是由18號染色體三體造成。我們雖未做3號和8號染色體數目的檢測，但結合文獻報道，推測bcl-6基因3拷貝和c-myc基因3拷貝可能也分別為3號染色體三體和8號染色體三體所致。目前，關于涎腺淋巴瘤的分子遺傳學研究較少，染色體異常的發生率有關的文獻鮮有報道。本組涎腺淋巴瘤中的MALT淋巴瘤病例其18號染色體三體和bcl-6基因3拷貝檢出率高，常見MALT淋巴瘤的染色體易位檢出率為0，這表明18號染色體三體和bcl-6基因3拷貝（可能為3號染色體三體所致）是本組MALT淋巴瘤最常見的遺傳學異常。如上所述，利用間期FISH檢測病變組織可作為淋巴瘤分類的重要輔助手段。MALT淋巴瘤是涎腺最常見的淋巴瘤類型，18號染色體三體及bcl-6基因3拷貝（可能為3號染色體三體所致）是其最常見的遺傳學異常。MALT淋巴瘤對于手術或局部放射治療敏感，預后較好[12]。但研究顯示，發病于頭頸部MALT結外邊緣區的B細胞淋巴瘤存在高發病率和高復發率的特點[6]。但遺憾的是本組FL及DLBCL病例數少，有待積累更多樣本進一步研究。MALT淋巴瘤有4組常見染色體易位類型，但本組未檢測出該4組染色體易位類型，可能與病變部位或致病因素不同有關或有其他未知因素，尚待進一步研究。

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Expression and clinic significance of gene-associated lymphoma of salivary glands

CAI Jie*，ZHANG Pinnan，GUO Qun.
*RenJi College，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To investigate clinicopathological and genetic characteristics of Lymphoma of salivary glands.Methods:Clinical，morphological and immunohistochemical feature of 32 cases of lymphoma in salivary glands were studied，including 5 cases of rective lymphoid hyperplasia and 32 lymphomas，retrospectivily. Classification of the lymphomas were made assording to the WHO classification of tumors of haemtopoietic and lymphoid tissues. All cases were studied with interphase fluorescence in situ hybridization(FISH)using dual color break apart probes of IgH，MALT1，bcl-6，c-myc，bcl-2，CCND1，bcl-10，and FOXP1 for detection of chromosomal aberrations，involving IgH，MALT1，bcl-6，c-myc，bcl-2，cyclinD1，bcl-10 and FOXP1 gene，repectively. FISH with IgH/bcl-2 dual fusion probe was used for detection of t(14；18)(q32；q21)/IgH-bcl-2. CEP18 sepctrum orange probe was used for detection of aneuploidy of the chromosome 18.Results:Among 32 cases of lymphoma，28 cases(87.5%)were extranodal marginal zone B-cell lymphoma of mucosa associated lymphoid tissue(MALT lymphoma)，2 cases were fol-licular lymphoma(FL)and 2 cases diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL). Among the 28 cases of MALT lymphoma，chromosomal aberration were found in 60.7%(17/28)with interphase FISH analysis. One case showed positive IgH break-apart signal with unknown partner，16 cases showed three copies of different genes，of which，three copies of MALT1，bcl-6，and c-myc were identified in 7 cases(25%)，12 cases(43%)，and 2 cases(8%)of MALT lymphomas， respectively.In addition，5 cases showed two genes，including three copies of bcl-6 and MALT1 in 4 cases，and three copies of bcl-6 together with c-myc in one case. Furthermore，all cases with three copies of MALT1 had trisomy 18(14；18)(q32；q21)was detected in both follicular lymphomas.Of the 2 DLBCL cases，one showed three copies of bcl-6 together with trisomy18 and the other one showed three copies of bcl-6 together with IgH and c-myc rearrangements. Chromosomal aberration was not found in all 5 cases of reactive lymphoid hyperplasia.Conclusion:The most common entity of lymphoma of salivary gland is MALT lymphoma and FISH is helpful for their differential diagnosis and classification. Trisomy 18 and three copies of bcl-6 are common chromosomal aberrations in lymphoma of salivary glands.

salivary gland neoplasms；lymphoma；in situ hybridization；immunohistochemistry

R557.1

A

1000-2138（2012）06-0561-05

2012-02-24

蔡杰（1990-），男，浙江瑞安人，本科生。

張品南，主任醫師，Email: zpn8271@126.com。

丁敏嬌）

·技術與方法·