大鼠AQP7基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在3T3-L1脂肪細胞中的表達

潘偉，谷雪梅，沈飛霞

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 溫州 325000）

大鼠AQP7基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在3T3-L1脂肪細胞中的表達

潘偉，谷雪梅，沈飛霞

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 溫州 325000）

目的：構(gòu)建攜帶大鼠AQP7基因的腺病毒載體，并檢測其在3T3-L1脂肪細胞中的表達。方法：采用RT-PCR方法，從大鼠脂肪組織中擴增克隆大鼠AQP7基因，插入到穿梭質(zhì)粒中獲得重組質(zhì)粒pDC316-AQP7。PCR、酶切鑒定后，重組穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染293細胞出毒產(chǎn)生重組腺病毒。經(jīng)PCR進行鑒定，轉(zhuǎn)染293細胞擴增并純化，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID 50）方法測定腺病毒滴度。體外轉(zhuǎn)染分化成熟的3T3-L1細胞，用Western blot方法檢測AQP7的表達水平。結(jié)果：PCR、酶切及測序證實重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確。同時成功構(gòu)建AQP7重組腺病毒，并制備出高滴度的病毒保存液，可以有效轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞。結(jié)論：成功構(gòu)建了含大鼠AQP7基因的重組腺病毒載體且其可以在3T3-L1細胞中有效表達，為今后更好地研究AQP7在肥胖發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

水通道蛋白7；重組腺病毒；3T3-L1細胞；大鼠

水通道蛋白7（AQP7）為近年來發(fā)現(xiàn)的肥胖相關(guān)基因，其在脂肪組織中大量分布，參與甘油轉(zhuǎn)運而影響脂肪代謝，與肥胖形成關(guān)系密切。多項研究[2-4]顯示，AQP7功能下降或缺失致使脂肪細胞中甘油堆積，進而促進甘油三酯的合成，引起糖脂代謝紊亂，最終可能導(dǎo)致肥胖和（或）2型糖尿病的發(fā)生。AQP7對甘油的運輸作用使人們對肥胖有了新的認識，從而對肥胖的研究進入一個嶄新的領(lǐng)域。通過選擇性增加脂肪細胞AQP7的表達，可望在肥胖治療方面發(fā)揮重要作用。正如文獻[5]報道給機體補充AQP1，可以有效治療干燥綜合征。

近來興起的基因治療為肥胖的防治提供了新的思路，但目前關(guān)于AQP7基因腺病毒載體的構(gòu)建國內(nèi)外亦鮮有報道。3T3-L1脂肪細胞是體外研究糖脂代謝和相關(guān)藥物作用機制的重要模型。既往研究顯示3T3-L1細胞表面腺病毒受體水平過低以致腺病毒轉(zhuǎn)染效率低下[6]，因此，本研究在體外條件下轉(zhuǎn)染AQP7基因重組腺病毒載體的時候加用多聚賴氨酸來增加腺病毒與3T3-L1細胞的黏附，進而觀察3T3-L1細胞中AQP7的表達，為進一步探討AQP7在肥胖發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級雄性SD大鼠5只（200～250 g），購自溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心；3T3-L1細胞購自中國科學(xué)院細胞庫；AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)購自北京本元正陽基因有限公司；感受態(tài)DH5α由本實驗室自備；限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs公司；T4 DNA連接酶購自MBI公司；脂肪組織RNA提取試劑盒購自QIGEN公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA marker DL2000和DNA片段回收試劑盒購自Takara公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；PCR純化試劑盒購自V-gene公司；PCR引物合成及DNA序列分析由北京本元正陽基因技術(shù)有限公司完成；胰島素（INS）、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）、多聚賴氨酸購自Sigma公司；兔抗鼠AQP7多克隆抗體購自Abcam公司；β-actin抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取：取新鮮大鼠內(nèi)臟脂肪組織100 mg于液氮中反復(fù)碾磨成粉末樣，按試劑盒操作說明提取脂肪組織總RNA。

1.2.2 RT-PCR克隆AQP7基因：取1μg RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA鏈，然后以此單鏈為模板進行PCR反應(yīng)。根據(jù)GenBank中AQP7的核苷酸序列（NM_019157.2）設(shè)計引物：上游引物序列為5’- ACT TAGCGGCCGCATGGCCGGTTCTGTGCTGGAGAACATACA-3’（下劃線為NotI酶切位點），下游引物序列為5’-ACTTAAAGCTTCTAAGAACCCTGTGGTGGTATGCCGGCG-3’（下劃線為HidIII酶切位點）。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30次循環(huán)后72 ℃延伸5 min，擴增后產(chǎn)物對比DL2000明確目的條帶大小，按照膠回收試劑盒說明回收AQP7基因片段。

1.2.3 重組腺病毒pDC316-AQP7穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建：pDC316質(zhì)粒和AQP7基因分別經(jīng)NotI和HindIII 37 ℃雙酶切3 h后，用凝膠提取試劑盒回收相應(yīng)片段，在T4 DNA連接酶25 ℃室溫連接3 h。取5 μL連接產(chǎn)物熱休克法轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH-5α，接種到含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)過夜，次日挑取白色陽性單克隆菌落搖菌，提取重組質(zhì)粒pDC316-AQP7。重組質(zhì)粒PCR擴增產(chǎn)物電泳鑒定，續(xù)用NotI和HindIII雙酶切，取8μL酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳、鑒定。測序結(jié)果通過NCBI上BLAST比對分析。

1.2.4 雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞，同源重組產(chǎn)生重組腺病毒：轉(zhuǎn)染前一天，把293細胞接種到6孔板內(nèi)，每孔5×105個細胞，培養(yǎng)基為含10% Hyclone胎牛血清的DMEM，37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞生長至底面積的80%～90%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染當(dāng)天更換新鮮培養(yǎng)基，取骨架質(zhì)粒pBHGlox_E1，3Cre和重組穿梭質(zhì)粒pDC316-AQP7，按照Lipofectamine 2000脂質(zhì)體說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染次日將長滿的細胞傳代于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察，待細胞長滿瓶底時，再傳入75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，每天觀察細胞出毒跡象。待細胞大部分病變并從底部脫落進行收毒。將出毒的細胞培養(yǎng)瓶先后置于-70 ℃冰箱和37 ℃水浴鍋中反復(fù)凍融三次，使病毒從病變細胞中充分釋放。將凍融液3000 r/min離心5 min，收集含病毒的上清液，棄沉淀。該上清即為第一代毒種（P1），作為隨后大量病毒擴增的毒種。

1.2.5 Ad5-AQP7病毒毒種鑒定：待25 cm2細胞瓶中培養(yǎng)的293細胞生長至90%時，取上述第一代毒種500μL接種。待細胞完全病變時按前述方法凍融3次，離心收集病毒上清液，此即為第二代毒種（P2）。取50μL P2毒種上清液，加入2μL蛋白酶K，56 ℃溫育，煮沸10 min，冰浴冷卻，取1μL作為模板，進行PCR鑒定。上游引物5’-TTCCACAATGG CCGGTTCTGT-3’，下游引物5’-TCCAATCTCTAAGAACCCT GT-3’，產(chǎn)物大小824 bp。以不攜帶目的基因片段的pDC316質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞獲得的腺病毒粗提液為陰性對照。

1.2.6 Ad5-AQP7重組腺病毒生產(chǎn)和純化：病毒生產(chǎn)過程：在75 cm2方瓶中接種4×106293細胞，培養(yǎng)過夜，待細胞生長至90%，取2 mL P2代毒種接種培養(yǎng)瓶內(nèi)，44 h后顯微鏡下觀察細胞完全病變。收獲病變細胞混懸液后反復(fù)凍融3次，離心取上清，按同樣方法接種于另外75 cm2方瓶中直至收獲足量病變細胞混懸液。

病毒純化方法：細胞混懸液3000 r/min離心10 min，棄上清，細胞沉淀用Tris緩沖液重懸，反復(fù)凍融3次，6000 r/min離心后取上清，用DNase酶消化后，經(jīng) 0.45μm的濾膜過濾，然后進行柱純化。離子交換純化后，然后再用分子篩進一步純化，將純化后的病毒保存于腺病毒保存液中，經(jīng)除鹽處理后用0.22μm一次性濾器過濾出菌，用從而得到無菌的純化病毒，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.7 純化病毒的滴度測定：①用10×的病毒裂解液裂解純化病毒樣品，測定OD260和OD280值，計算每毫升制品中的病毒顆粒數(shù)（VP/mL）=OD260×1.1×1012。②參照LaBarre等[7]方法測定病毒制品的TCID 50值。

1.2.83 T3 -L1細胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化：3T3-L1前脂肪細胞用10%新生小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細胞融合2 d后，加含有0.5 mmol/L IBMX、1μmol/L DEX和5μg/mL INS的10% FBS的DMEM培養(yǎng)48 h，更換含5μg/mL INS的培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h，隨后用10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，2 d換液一次，至細胞分化為成熟的脂肪細胞。

1.2.9 重組腺病毒Ad5-AQP7轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞及Western blot法檢測蛋白表達：參考Orlicky等[6]的方法，在DMEM培養(yǎng)基中加入多聚賴氨酸溶液成終濃度0.5μg/mL，加入病毒液（MOI為300），室溫靜置100 min。PBS洗板2次后六孔板內(nèi)每孔加入上述包含病毒溶液，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置1.5 h后每孔另加DMEM補足。24 h后更換為10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。

培養(yǎng)72 h后吸棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細胞2次后，每孔加入細胞裂解液100μL，刮起細胞，細胞懸液過27G針頭數(shù)次，冰上靜置30 min后12000 r/min 4 ℃離心20 min，吸取上清用BCA法測定蛋白濃度。蛋白置于-80 ℃冰箱保存。電泳前按4:1體積比與5×loading buffer 混合，100 ℃ 熱變性5 min。取50μg蛋白上樣12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫搖床封閉1 h，一抗AQP7（1:500）或β-actin（1:3000）4 ℃孵育過夜，次日與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h后，加ECL試劑反應(yīng)，顯像，成像。

2 結(jié)果

2.1 AQP7 cDNA PCR結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后在750～1000 bp之間有條帶明顯，與預(yù)先設(shè)計的AQP7 DNA長度相符，而陰性對照未見擴增條帶（見圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒pDC316-AQP7鑒定

2.2.1 重組質(zhì)粒PCR鑒定：重組pDC316-AQP7質(zhì)粒擴增后電泳，出現(xiàn)810 bp大小條帶，陽性質(zhì)粒構(gòu)建成功（見圖2）。

圖2 pDC316-AQP7質(zhì)粒PCR鑒定

圖3 重組pDC316-AQP7質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.2.2 雙酶切鑒定：經(jīng)NotI+HindIII雙酶切后凝膠電泳觀察到5.8 kb和810 bp大小2個片段，與預(yù)期結(jié)果相符，該質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確（見圖3）。

2.2.3 測序鑒定：經(jīng)測序比對分析，其核酸序列與GeneBank中AQP7的mRNA編碼序列（NM_019157.2）同源性完全一致。

2.3 重組腺病毒Ad5-AQP7的包裝和鑒定

2.3.1 重組腺病毒包裝：雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞8 d后出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)，表現(xiàn)為細胞變大變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑（見圖4）。

圖4293 細胞出毒現(xiàn)象（×200）

2.3.2 Ad5-AQP7毒種PCR鑒定：提取P2病毒毒種的DNA進行PCR，同時用pDC316-AQP7質(zhì)粒作為陽性對照，可以擴增出824 bp大小的基因片段，證實該重組病毒含有目的基因，而作為陰性對照的不攜帶AQP7基因的空載腺病毒沒有擴增條帶（見圖5）。

圖5 Ad5-AQP7毒種PCR鑒定

2.3.3 Ad5-AQP7病毒滴度測定：檢測結(jié)果顯示重組腺病毒顆粒數(shù)為7.36×1011VP/mL，TCID50免疫法測得感染滴度為1.58×1010IU/mL，分裝凍存以備后續(xù)實驗。

2.4 重組腺病毒在3T3-L1細胞中的表達 分化成熟的3T3-L1脂肪細胞中可見AQP7的表達，轉(zhuǎn)染Ad5-AQP7重組腺病毒后其含量明顯升高（P＜0.01）（見圖 6）。

1.分化成熟3T3-L1脂肪細胞；2.轉(zhuǎn)染空載腺病毒；3.轉(zhuǎn)染Ad5-AQP7與1組比：aP<0.01

3 討論

自1988年Agre等在鑒定人類Rh血型抗原時偶然發(fā)現(xiàn)了一種紅細胞膜上的新28 ku 蛋白，即后來被命名的AQP1以來，至今在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白（AQP 0～12）。這些AQPs在通透水的功能上有著相似之處，但由于表達部位及含量的不同，又發(fā)揮著各自特異的生理功能。AQP7作為其中一員，除了可以運輸水分子之外，還可以運輸甘油、尿素等小分子物質(zhì)，此基因最早從人的脂肪細胞中克隆成功，由于其mRNA水平在脂肪組織中表達豐富，故又被命名為脂肪水通道蛋白（aquaporin adipose，AQPap）。在體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)隨著3T3-L1細胞分化進程，AQP7 mRNA水平表達逐漸上升，并且培養(yǎng)基中甘油濃度也平行增加，這種效應(yīng)可以被水通道蛋白的非特異性拮抗劑汞離子所阻滯，表明AQP7主要介導(dǎo)脂肪動員產(chǎn)生的甘油輸出過程[8]。Hibuse等[3]用RNAi敲除AQP7的3T3-L1細胞發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)甘油含量上升，油酸攝取增加，甘油激酶活性提高，從而促進甘油三酯的合成導(dǎo)致細胞內(nèi)甘油三酯的蓄積促成脂肪細胞的肥大。這些結(jié)果顯示AQP7在調(diào)控脂肪代謝方面起著關(guān)鍵的媒介作用，與肥胖的形成關(guān)系密切。

基因治療是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究中最具前景的研究之一，而腺病毒載體是近年來發(fā)展起來的基因運載系統(tǒng)。其優(yōu)點突出，對分裂和非分裂細胞均可以轉(zhuǎn)染，感染能力強，外源基因容量大，不整合到宿主基因組，此外，相比慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒還具有病毒滴度高，易于操作等優(yōu)點[9]。本實驗選用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)，通過Cre/loxP獲得重組病毒，這個過程發(fā)生在293細胞中，從而避免在細菌中重組，操作簡便、重組效率高以及可以獲得較高的病毒產(chǎn)率。本實驗通過此腺病毒包裝系統(tǒng)，獲得高純度、高滴度的Ad5-AQP7重組腺病毒，經(jīng)過鑒定構(gòu)建成功，足夠滿足后續(xù)的細胞和動物要求。

3T3 -L1細胞系是3T3的一個亞型，有自發(fā)分化為脂肪細胞的特性，但自發(fā)分化率較低。加入具有促成脂作用的誘導(dǎo)劑后，大部分細胞可以分化為成熟脂肪細胞。與Orlicky等[6]研究結(jié)果一致，通過多聚賴氨酸可增加腺病毒與3T3-L1細胞的黏附力并且在細胞中高效穩(wěn)定表達，實驗結(jié)果證實重組腺病毒在3T3-L1細胞中得到表達。本研究成功構(gòu)建大鼠AQP7重組腺病毒，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞，為進一步研究AQP7與脂肪代謝的相關(guān)性奠定了良好實驗基礎(chǔ)，并對疾病的基因治療有一定的指導(dǎo)意義。

[1] Arner P. Human fat cell lipolysis: biochemistry, regulation and clinical role [J]. Best Practice Research Clin Endocrinol Metab,2005,19(4):471-482.

[2] MacDougald OA, Burant CF. Obesity and metabolic perturbations after loss of aquaporin 7, the adipose glycerol transporter [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(31):10759-10760.

[3] Hibuse T, Maeda N, Funahashi T, et al. Aquaporin 7 deficiency is associated with development of obesity through activation of adipose glycerol kinase [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(31):10993-10998.

[4] Hara-Chikuma M,Sohara E,Rai T,et al. Progressive adipocyte hypertrophy in aquaporin-7-deficient mice: adipocyte glycerol permeability as a novel regulator of fat accumulation[J]. J Biol Chem,2005,280(16):15493-15496.

[5] 楊軍, 楊彥春. 腺病毒介導(dǎo)AQP1基因治療涎腺干燥綜合征的實驗研究 [J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2005, 34(3): 323-235.

[6] Orlicky DJ, Schaack J. Adenovirus transduction of 3T3-L1 cells [J]. J Lipid Res,2001,42(3):460-466.

[7] LaBarre DD,Lowy RJ. Improvements in methods for calculating virus titer estimates from TCID50 and plaque assays[J]. J Virol Methods, 2001, 96( 2) : 107-126.

[8] Kishida K, Kuriyama H, Funahashi T, et al. Aquaporin adipose, a putative glycerol channel in adipocytes [J]. J Biol Chem,2000,275(27):20896-20902.

[9] Campos SK, Barry MA. Current advances and future challenges in adenoviral vector biology and targeting [J]. Curr Gene Ther,2007,7(3):189-204.

Construction of rat AQP7 recombinant adenovirus vector and its expression in 3T3-L1 cells

PAN Wei，GU Xuemei，SHEN Feixia.Department of Endocrinology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

Objective:To construct the recombinant adenovius vector carrying rat AQP7 and transfect the 3T3-L1 cells.Methods:The full cDNA sequence was obtained from rat adipose tissue using RT-PCR. The AQP7 gene was inserted into pDC316 shuttle plasid in order to produce recombinant pDC316-AQP7. After the identification of PCR，restriction endonuclease digestion and sequencing，the recombinant pDC316-AQP7 shuttle plasid coinfected with rescue plasmid into 293 cells by Lipofectamine 2000. The recombinant adenovirus vector(Ad5-AQP7)was confirmed by PCR，and then amplified in 293 cells and purified. The titer was used 50% tissue culture infective dose(TCID)assay. 3T3-L1 cells were transfected with Ad5-AQP7 and the expression of AQP7 gene was detected with Western blot.Results:PCR，restrition endonuclease digestion and sequencing analysis confirmed the construction of pDC316-AQP7 shuttle plasmid.Recombinant adenovius with high titer was produced and could express efficiently in 3T3-L1 cells.Conclusion:Recombinant adenovirus vector carring rat AQP7 gene(Ad5-AQP7)is success-fully constructed and can be expressed in 3T3-L1 cells，which may provide a potent tool to investigate the function of AQP7 during the development of obesity.

AQP7；adenovirus；3T3-L1 cells；rats

Q784

A

1000-2138（2012）06-0521-05

2012-01-26

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（Y2080418）。

潘偉（1985-），女，浙江溫州人，碩士生。

沈飛霞，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：sfx 301@163.com。

丁敏嬌）

·臨床經(jīng)驗·