姜黃素干預慢性應激大鼠體內皮質酮的動態變化和組織水平

費愛麗，張立康，胡國新，，李軍偉，周紅宇，

（溫州醫學院，浙江 溫州 325035，1.藥學院 藥理教研室；2.分子藥理毒理研究所）

姜黃素干預慢性應激大鼠體內皮質酮的動態變化和組織水平

費愛麗1，張立康1，胡國新1，2，李軍偉2，周紅宇1，2

（溫州醫學院，浙江 溫州 325035，1.藥學院 藥理教研室；2.分子藥理毒理研究所）

目的：研究慢性應激大鼠體內皮質酮（CORT）變化的動態規律和組織差異，觀察姜黃素的干預特點。方法：束縛法建立大鼠慢性應激模型，姜黃素灌胃給藥，研究體質量變化、曠場實驗、血漿和組織中CORT水平。分別于束縛前、束縛后30、90、120、240和360 min連續取血。采用高效液相色譜法檢測大鼠血漿與各組織中皮質酮水平。結果：慢性應激大鼠體質量增加緩慢，曠場實驗中穿格數和直立次數減少，潛伏期延長，姜黃素不加快體質量增加，但可改善部分行為學指標。應激組大鼠第1天于束縛后30、90和120 min CORT水平持續升高，第7、第14和第21天僅在30 min時出現CORT水平升高，第1～第14天姜黃素不影響30 min的CORT高峰，但可加速CORT下降，且使基礎狀態組織內CORT濃度降低。結論：姜黃素不損害下丘腦-垂體-腎上腺軸的急性反應能力，但可阻止慢性應激時CORT的持續升高，且使腦、肝等組織局部CORT含量下降，此可能是其抗應激作用的基礎。

姜黃素；應激；皮質酮；高效液相色譜；大鼠；動物模型

糖皮質激素為應激激素，在大鼠體內的活性形式是皮質酮（corticosterone，CORT）。慢性應激時CORT釋放增加是誘發各種病理過程的重要因素。姜黃素（curcumin）是傳統中藥姜黃、莪術、郁金等的有效成分之一，可拮抗慢性應激所導致的CORT水平升高，從而防止其下游信息通路的過度激活[1-4]。但近年來，也有研究表明，抑郁、創傷后壓力心理障礙癥（PTSD）、糖尿病、慢性疲勞綜合征和纖維肌痛等慢性應激相關的疾病存在CORT不足的情況[5]。那么姜黃素降低CORT水平的作用是否會造成機體在應激反應時CORT的不足呢？本研究檢測了慢性應激大鼠接受束縛時血漿中CORT水平的動態變化和結束束縛后血漿及各組織中CORT的水平，觀察長期給予姜黃素的干預效果，以全面闡述姜黃素對慢性應激大鼠血漿及靶組織中CORT水平的調節作用。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑 姜黃素（sigma公司產品），C1386，用少量二甲基亞砜（DMSO）溶解后用玉米油配成5 mg·mL-1，灌胃給藥。卡馬西平標準品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號：0142 9503。CORT標準品（Q1550-020，CAS50-22-6）和11-去氫皮質酮（11-dehydrocorticosterone，11-DHC。Q3690-000，CAS 72-23-1）標準品為美國steraloids公司產品。乙腈、三氟乙酸、乙酸乙酯等購自天津四友生物醫學技術有限公司，一級色譜純。乙醚為分析純，宜興市第二化學試劑廠產品。

1.2 實驗動物 SD大鼠58只，雌雄各半，體質量180～220 g，清潔級，由溫州醫學院實驗動物中心提供。動物合格證號：SYXR（浙）2010-0158。

1.3 儀器 高效液相色譜儀為美國Agilent1100系列，包括G1322A在線脫氣機、G1311A四元泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315B二極管陣列檢測器、Agilent化學工作站[RevA 08.03.（847）]。電子分析天平，組織勻漿機，渦旋混合器，水浴恒溫振蕩器，臺式高速離心機，氮吹儀等。

1.4 大鼠慢性應激模型的建立 采用束縛法建立大鼠慢性應激模型。每天10:00-11:30給藥，11:00-12:30用特制的大鼠固定器將大鼠束縛，至17:00-18:30解除束縛，連續21 d。

1.5 動物的分組、給藥及取樣 第一批大鼠40只，隨機分為4組。對照（CON）組只給予玉米油灌胃，不予束縛；應激（STRESS）組玉米油灌胃+束縛360 min；低劑量（JHS10）組10 mg/mL姜黃素灌胃+束縛360 min；高劑量（JHS20）組20 mg/mL姜黃素+束縛360 min。每天灌胃后60 min束縛，連續21 d。記錄大鼠體質量，于第22天進行曠場實驗。每只大鼠曠場實驗觀察5 min自發活動后處死，取血、肝、腎上腺和腦組織，稱重并測CORT含量。為避免糖皮質激素分泌的晝夜規律干擾，將大鼠束縛的起止日期錯開，曠場實驗和大鼠處死取樣均控制在3 min內完成，在每天的13:00-15:00之間進行。

第二批大鼠18只，隨機分為3組。對照（CON）組只給予玉米油灌胃；應激（STRESS）組玉米油灌胃+束縛360 min；給藥（JHS10）組10 mg/mL姜黃素灌胃+束縛360 min。每天灌胃后60 min束縛，連續21 d。分別于第1天、第7天、第14天和第21天從尾靜脈取血，取血時間為束縛前（記為0 min）、束縛30、90、120、240和360 min，每次取血0.3 mL。

1.6 曠場實驗 曠場大小為100 cm×100 cm×50 cm，箱體黑色，底面用白線劃分為25個面積相同的小格，沿墻格為外周格，其余為中央格，上方有攝像機。將大鼠置于中央格內，開始計時，觀察并記錄5 min內動物在中央格內的停留時間（潛伏期）、穿格數、直立次數、理毛次數和糞便數。

1.7 高效液相色譜法檢測血漿和各組織的CORT水平

1.7.1 色譜條件：色譜柱為Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動相為乙腈-水-0.1%三氟乙酸（31:29:40經15 min比例變為41:19:40）；流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為246 nm。

1.7.2 血漿及各組織樣品的預處理：準確吸取待測血液樣品0.3 mL于10 mL具塞試管中，加入20 μg/mL的卡馬西平內標工作液50μL，混勻后加入0.01 mol/L鹽酸溶液200μL。再加入乙酸乙酯3.0 mL，漩渦混勻2 min。靜置10 min后轉移上層有機相于另一刻度離心管中，氮吹儀中吹干。用200μL流動相復溶，取復溶液于自動進樣器的樣品瓶中，設定20μL進樣檢測。

取腦/肝/腎組織稱重，按每0.1 g加入0.1 mL 0.9%氯化鈉溶液勻漿，準確吸取0.3 mL勻漿于10 mL具塞試管中；腎上腺稱重后按每16μg加入100μL 0.9%氯化鈉溶液勻漿，準確吸取0.15 mL勻漿于10 mL具塞試管中。加入20μg/mL的卡馬西平內標工作液50μL，混勻后加入0.01 mol/L鹽酸溶液200μL。再加入乙酸乙酯3.0 mL，漩渦混勻2 min后3000 r/min離心，轉移上層有機相于另一刻度離心管中，氮吹儀中吹干。用200μL流動相復溶，取復溶液于自動進樣器的樣品瓶中，設定20μL進樣檢測。

1.7.3 HPLC圖和標準曲線：

標準品HPLC見圖1。CORT的標準曲線為y2=0.9078x2+0.0016（r=0.9995，n=6，RSD=3.72%）；去氫皮質酮為y1=0.6309x1-0.0003（r=0.994，n=6，RSD=6.61%）。

圖1 標準品HPLC圖

1.8 統計學處理方法 采用SPSS13.0軟件分析。大鼠體質量及血漿CORT水平的動態變化采用一般線性模型（GLM）的repeated measures和multivariate過程進行重復測量數據的多元方差分析；第21天血漿與各組織CORT水平的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。根據方差齊性與否，分別采用LSD法或Games-Howell法進行兩兩比較。

2 結果

2.1 對大鼠慢性應激模型的評價 圖2顯示大鼠體質量的變化。第1天各組體質量無明顯差異。第7、第14、第21天，CON組大鼠體質量迅速增加，而STRESS組大鼠體質量增加緩慢，兩組之間差異有統計學意義（P＜0.01）。JHS10和JHS20組大鼠體質量增加緩慢，與CON組之間差異有統計學意義（P＜0.01），而與STRESS組之間差異無統計學意義（P＞0.05），提示姜黃素并不加快慢性應激大鼠的體質量增加。

圖2 姜黃素對慢性應激大鼠體質量的影響

表1為大鼠自發活動的各項指標變化。與CON組相比，STRESS組大鼠潛伏期延長，穿格數和直立次數減少，而JHS10和JHS20組有明顯改善。

表1 姜黃素對慢性應激大鼠自發活動的影響（n=10，±s）

表1 姜黃素對慢性應激大鼠自發活動的影響（n=10，±s）

與CON組比：aP<0.05，bP<0.01；與STRESS組比：cP<0.05，dP<0.01

組別CON STRESS JHS10 JHS20穿格數85.0±28.4 55.7±24.9a 85.7±43.0c 95.2±22.7d直立次數27.1±10.2 15.1±6.1b 18.0±8.1 24.3±9.6c理毛次數3.5±1.7 2.7±1.5 2.4±1.2 2.8±1.1糞便數1.7±1.1 1.0±1.2 0.9±1.1 1.4±2.1潛伏期5.4±2.4 13.1±6.6b 7.6±3.4d 7.3±1.8d

2.2 血漿CORT的動態變化 慢性應激大鼠血漿CORT水平的動態變化見圖3-4。

圖3為各組內不同時間點與束縛前（0 min）的比較。以每次束縛前的CORT濃度為基礎水平，CON組第1、第7和第14天各時間點的CORT水平與基礎水平相比差異均無統計學意義（P＞0.05），僅第21天240和360 min的CORT水平低于基礎水平（P＜0.01或P＜0.05）；STRESS組第1天于束縛的30、90和120 min CORT水平持續高于基礎水平（P＜0.01或P＜0.05），240和360 min時則降至基礎水平以下（P＜0.01或P＜0.05），第7、第14和第21天則僅在30 min時出現CORT水平升高（P＜0.01或P＜0.05），個別持續至90 min（P＜0.01），后降至基礎水平或以下，提示大鼠在急性應激時血漿CORT水平明顯升高且可持續較長時間，但長期處于應激狀態機體可能發生適應性調整，血漿CORT水平僅有短暫升高；JHS10組第1、第7和第14天于束縛的30 min出現CORT水平升高（P＜0.01），90 min即下降，240和360 min時可降至基礎水平以下，第21天則無CORT上升高峰，且120 min時CORT即降至基礎水平以下，即姜黃素連續給藥1～14 d不抑制大鼠應激時血漿CORT高峰的出現，但可加速高峰后CORT水平的下降，縮短CORT在高濃度持續的時間，而連續給藥達21 d時則完全抑制了應激大鼠血漿CORT高峰的出現。

圖4為同一時間點各組間CORT濃度的比較。可見CON組、STRESS組和JHS10組的基礎水平均無明顯差異。與CON組相比，STRESS組在第1天束縛后30、90 min、第7天束縛后30 min、第14天束縛后30、90、120 min和第21天束縛后30、90、120 min均出現CORT水平明顯升高，到束縛后240或360 min時各組CORT降至基礎水平；JHS10組在第1天束縛后90、120 min、第7天束縛后120、240、360 min、第14天束縛后120、240 min和第21天束縛后30、90、120、240 min CORT水平均低于同一時間點的STRESS組水平，提示姜黃素可以阻止應激導致的血漿CORT水平升高。

圖3 各組內不同時間點CORT濃度的動態變化

圖4 在同一時間點各組間CORT濃度的比較

2.3 各組織CORT水平的改變 大鼠經21 d束縛后，第22天檢測血漿及各組織的CORT水平，結果見表2。從表2可見，大鼠血漿CORT水平各組均無明顯差異。腎組織中CORT水平亦無明顯改變。腦和肝組織中，STRESS組的CORT水平與CON組相比均明顯降低。而腎上腺組織中，STRESS組的CORT水平與CON組相比則明顯升高。

表2 姜黃素對慢性應激大鼠血漿及各組織中CORT水平的影響（n=10，±s）

表2 姜黃素對慢性應激大鼠血漿及各組織中CORT水平的影響（n=10，±s）

與CON組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與STRESS組比：cP＜0.05，dP＜0.01

血漿0.58±0.157 0.62±0.082 0.63±0.131 0.59±0.149組別CON STRESS JHS10 JHS20腦0.41±0.039 0.20±0.082b 0.23±0.077 0.06±0.02d肝臟0.32±0.134 0.17±0.080b 0.05±0.022c 0.05±0.013c腎上腺3.79±0.930 6.53±0.773b 5.66±1.180 6.02±1.786腎臟0.17±0.060 0.20±0.059 0.21±0.055 0.23±0.095

上述結果表明，不論是慢性應激還是姜黃素治療，對于基礎狀態的血漿CORT水平均無影響；慢性應激可使腎上腺組織CORT水平增加，但同時腦和肝組織內CORT水平降低；姜黃素治療不能糾正慢性應激引起的上述改變，反而使其腦和肝組織內CORT進一步降低，而腎上腺內CORT水平保持高于CON組的狀態。

3 討論

長期束縛是制備慢性應激模型的經典方法，通常以體質量變化和曠場實驗作為評價模型是否成功的指標。慢性應激可導致大鼠體質量增加緩慢[6]和曠場行為[7]的改變，如探究行為減少和活動抑制[8]。本研究中，STRESS組和CON組相比，體質量增加緩慢，穿格數和直立次數減少，潛伏期延長，提示本研究采用的束縛方案可成功制備大鼠慢性應激模型；而姜黃素可增加束縛大鼠的穿格數和直立次數，縮短潛伏期，這與目前多數關于姜黃素抗抑郁作用的研究[9]結果一致。

應激狀態時，下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸被激活，刺激腎上腺皮質合成和釋放CORT。持續過多的CORT破壞細胞功能，引起多種病理改變，包括海馬等腦組織損傷、胰島素抵抗、骨質疏松、行為學改變等。但另一方面，機體應激時CORT增多，通過調節靶細胞代謝和協調機體各方面資源，使之適應應激狀態，也是防止病理損害發生的重要途徑。已有研究表明，許多與慢性應激有關的疾病是由于長期應激狀態下CORT不足所致，如抑郁、PTSD、糖尿病、慢性疲勞綜合征和纖維肌痛等[5]。

本研究中，筆者于大鼠束縛前及束縛后的30、90、120、240和360 min連續取血，研究大鼠束縛應激時血漿CORT水平的動態變化，結果發現，大鼠束縛30 min后即在血漿中出現CORT高峰，并持續至120～240 min，但隨著束縛的連續進行，14 d后可發現CORT高峰持續時間縮短，至21 d時僅在30 min時出現高峰，反映出大鼠慢性應激時HPA逐漸耐受的過程（見圖3）。通常這是由于下丘腦CRH釋放過多，垂體CRH受體下調所致，可能也是許多慢性應激相關的疾病（如抑郁）同時存在CRH過多和CORT不足的原因。此外，各組大鼠束縛前血漿CORT水平各組間無明顯差異，同樣，第22天在大鼠不再接受束縛的情況下，血漿CORT水平各組間亦無差異（見表2），提示長期的束縛應激只減弱了HPA軸的急性反應能力，而并不影響其維持CORT基礎水平的功能，但此時組織內CORT的水平卻有明顯差異。應激組大鼠腎上腺組織CORT水平高于對照組，腦和肝組織中CORT水平低于對照組，說明循環中CORT能夠維持正常的基礎水平是腎上腺、肝臟和腦組織共同調節的結果。腎上腺是合成CORT的部位，受HPA軸的調節，同時CORT對HPA軸亦有負反饋抑制。肝臟以表達1型11-類固醇脫氫酶（11β-HSD1）為主，介導無活性的11-DHC還原為有活性的CORT，是體內CORT再生的重要途徑。腦內如海馬等部位亦以表達11β-HSD1為主，催化還原反應，調控局部CORT水平，對維持CORT對HPA軸的負反饋抑制作用有重要意義。據文獻報道，急性應激或給予CORT可使11β-HSD1活性增加，有助于應激反應時CORT水平的升高，慢性應激則使11β-HSD1活性下降，這反映了機體的自穩機制，可以防止長期持續的CORT過高帶來的機體損傷[10-11]。而第22天JHS10組的檢測結果（見表2）表明持續姜黃素治療可使組織局部的CORT水平進一步降低，可能也是通過組織中11β-HSD1調節的結果，因為此時血漿CORT水平無明顯改變，而腎上腺組織內的CORT水平是升高的。

姜黃素的抗應激作用已有大量研究證實，通常認為是抑制了應激所誘發的CORT增加，從而阻斷了高濃度CORT引發的某些基因蛋白水平的改變，如糖皮質激素受體（GR）表達減少，腦源性神經營養因子（DBNF）表達減少，鈣/鈣調素激酶通路激活，N-甲基門冬氨酸受體（NMDA受體）表達增加等，因這些變化是介導慢性應激時靶組織損傷的重要途徑[1-4]。而本研究結果證實，姜黃素可以防止慢性應激大鼠CORT水平的持續升高，同時又保持HPA軸的急性反應能力。從圖3可見，給予10 mg/kg的姜黃素并不抑制大鼠束縛后30 min出現的CORT高峰，通過這種短暫的CORT升高來調節靶細胞的代謝水平，使機體適應應激狀態，防止CORT不足造成的損傷。但JHS10組的CORT水平在高峰后即迅速下降，而不像STRESS組那樣持續至120 min。CORT水平的及時下降，使血漿和靶組織CORT基礎濃度維持正常甚至更低，阻斷了慢性應激時持續高水平的CORT所引發的病理過程。上述JHS10組的CORT變化趨勢一直保持到連續給藥的第14天，直到第21天才沒有出現明顯的CORT高峰。由于HPA軸功能降低，CORT不足是慢性應激性疾病的另一重要原因，姜黃素用于抗應激治療需要控制在一定的劑量和療程內。

[1] Bhatia N, Jaggi AS, Singh N, et al. Adaptogenic potential of curcumin in experimental chronic stress and chronic unpredictable stress-induced memory deficits and alterations in functional homeostasis[J]. J Nat Med, 2011, 65(3-4):532-43.

[2] Wei S, Xu H, Xia D, et al. Curcumin attenuates the effects of transport stress on serum cortisol concentration, hippocampal NO production, and BDNF expression in the pig[J].Domest Anim Endocrinol, 2010, 39(4):231-239.

[3] Xu Y, Lin D, Li S, et al. Curcumin reverses impaired cognition and neuronal plasticity induced by chronic stress[J].Neuropharmacology, 2009, 57(4):463-471.

[4] Xu Y, Ku B, Tie L, et al. Curcumin reverses the effects of chronic stress on behavior, the HPA axis, BDNF expression and phosphorylation of CREB[J]. Brain Res, 2006, 1122(1):56-64.

[5] Yehuda R, Seckl J. Mini review:Stress-related psychiatric disorders with low cortisol levels:a metabolic hypothesis[J]. Endocrinology, 2011, 152(12):4496-4503.

[6] Krahn DD, Gosnell BA, Majchrzak MJ. The anorectic effects of CRH and restraint stress decrease with repeated exposures[J]. Biol Psychiatry, 1990, 27(10):1094-1102.

[7] Swiergiel AH, Leskov IL, Dunn AJ. Effects of chronic and acute stressors and CRF on depression-like behavior in mice[J]. Behav Brain Res, 2008, 186(1):32-40.

[8] Klenerova V, legel M, kopek P, et al. Galanin modulating effect on restraint stress-induced short- and long-term behavioral changes in Wistar rats[J]. Neurosci Lett, 2011,502(3):147-151.

[9] Kulkarni S, hir A, kula KK, et al. Potentials of curcumin as an antidepressant[J]. Scientific World Journal, 2009, 9:1233-1241.

[10]Jamieson PM, uchs E, lugge G, et al. Attenuation of Hippocampal 11beta-Hydroxy-steroid Dehydrogenase Type 1 by Chronic Psychosocial Stress in the Tree Shrew[J]. Stress,1997, 2(2):123-132.

[11]Jellinck PH, Dhabhar FS, Sakai RR, et al. Long-term corticosteroid treatment but not chronic stress affects 11betahydroxysteroid dehydrogenase type I activity in rat brain and peripheral tissues[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 1997,60(5-6):319-323.

The interventional effect of curcumin on the dynamic changes of blood corticosterone and tissue level in the chronic-stressed rat

FEI Aili*，ZHANG Likang，HU Guoxin，LI Junwei，ZHOU Hongyu.
*School of Pharmacy，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To study the dynamic changes of blood corticosterone(CORT)and tissue level in the chronic-stressed rat. and observe the interventional cbaracteristics of curcumin on them.Methods:Chronic stress was induced by immobilizing the rats for 6 h daily for 21 days. Body weight and open field test were evaluated to assess stress-induced functional changes. Corticosterone in blood and tissue was assayed with high performance liquid chromatography(HPLC). The blood were collected before restrained and when restrained for 30，90，120，240 and 360 min in day 1，7，14 and 21.Rats were executed and the brain，liver，adrenal，kidney and blood were collected in day 22 when rats were not restrained.Results:Chronic stress resulted in weight loss and behavior deficits in rats. Curcumin could attenuate behavior deficits induced by chronic stress. In day 1 the blood level of CORT was increased when restrained for 30，90 and 120 min，but in day 7，day 14 and day 21，the blood level of CORT was increased only at 30 min restrained. Curcumin could not eliminate the CORT peak at 30 min restrained，but decreased the blood CORT level at the subsequent time.Curcumin also decreased the CORT level in brain and liver in day 22 when the rats were no longer restrained.Conclusion:These results suggest that curcumin prevents against the persis-tent rise of CORT induced by chronic stress but don’t reduce the responsiveness of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis(HPA). The change of CORT level intervened by curcumin in our stress model helps to protect rats against chronic stress.

curcumin；stress；corticosterone；HPLC；rats；animal model

R335

A

1000-2138（2012）06-0511-06

2012-03-31

國家自然科學基金資助項目（81102092）；浙江省自然科學基金資助項目（LY12H31002）；溫州市科技局國際合作項目（H20090024）。

費愛麗（1987-），女，浙江桐鄉人，碩士生。通信作者：周紅宇，副教授，Email：lxd54@163.com。

丁敏嬌）

·論 著·