美伐他汀發酵菌種篩選和發酵條件優化

胡一峰 曹一嵐 黃俊龍

（浙江震元制藥有限公司，浙江 紹興 312000）

膽固醇是甾醇類激素和膽汁酸的前體，對維持細胞膜的完整性和生物體的健康至關重要。然而，低密度脂蛋白（LDL）膽固醇含量過高時，可沉淀在動脈血管壁導致心血管病的發生，心血管病疾病是發達國家導致死亡的兩大疾病之一。人體有兩種膽固醇來源，一是膳食膽固醇在腸胃道經酰基CoA-膽固醇酰基轉移酶（ACAT）酯化生成，二是由酰基CoA經甲基戊酸途徑在肝中合成。肝中生物合成的膽固醇約占總膽固醇的60％～70％，所以它是降脂治療的首選目標。他汀類藥物是20世紀80年代后期國外上市的調血脂治療藥，是調節高膽固醇血癥、降低低密度脂蛋白、降低甘油三酯、提升高密度脂蛋白最有效的藥物［1-4］。從1987年首次面市以來，其市場銷售保持強勁增長勢頭。90年代以來，他汀類藥物的年銷售額都以20％的年平均增長率高速增長。90年代中期以后，每年都有三種他汀類藥物進入世界十大最暢銷的治療心血管藥物行列。據不完全統計，全球開發的他汀類藥物已有12個品種，在我國市場上已有8個品種，分別是阿托伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀［4-5］。

美伐他汀是桔青霉在發酵過程中的一種代謝產物，存在于菌絲中，屬HMG-CoA還原酶抑制劑，其作用是競爭性抑制HMG-CoA還原酶，該酶是膽固醇生物合成的限速酶，對哺乳動物和動物培養細胞的甾醇生物合成都有明顯的抑制作用［6］。美伐他汀于1976年由Akira Endo從真菌Penicillium Citrinum發現，并于1976年由A.G.Brown從Penicillium brvicompactum中單獨分離出來，其分子式為C23H24O5，分子量為390.52。作為第1個被發現的他汀類藥物，美伐他汀在該類藥物的研究開發上占有極其重要的地位。對美伐他汀產生菌的研究可以有效地提高美伐他汀的產量。我們對本公司保藏的美伐他汀生產菌進行了系統地篩選和誘變，獲得了傳代穩定的高產菌株，并對該菌株的培養條件進行了研究。

1 材料和方法

1.1 菌株

出發菌株桔青霉NS-3-16，為本公司所收集和保藏。

1.2 培養基

斜面培養基：蛋白胨1.0，黃豆粉1.0，硝酸鈉0.2，硫酸鎂0.1，葡萄糖4.0，瓊脂2.0，pH 6.0，121℃蒸汽滅菌30min；

搖瓶培養基：蛋白胨1.0，黃豆粉2.0，硝酸鈉0.2，硫酸鎂0.1，蔗糖10，pH 6.0，121℃蒸汽滅菌30min；

發酵培養基：蛋白胨1.0，黃豆粉2.5，硝酸鈉0.2，硫酸鎂0.1，蔗糖20，泡敵0.1，pH 6.0，121℃蒸汽滅菌30min；

1.3 培養條件

1.3.1 斜面培養條件

24±1℃恒溫培養培養箱9～11d。

1.3.2 搖瓶發酵培養條件

轉速230～250r/min的搖床上培養，24±1℃培養3～4d。

1.3.3 50L發酵罐發酵培養條件

裝量（消后體積）：20L；接種量：1L（5％）；培養溫度：24±1℃；通風量：1：1～1.2；罐壓：50kPa；轉速：100～300r/min，若溶氧低于40％，則小幅度提高轉速，并注意泡沫情況；發酵前期注意泡沫情況，及時滴加泡敵，防止逃液。

1.4 篩選方法

取出發菌株冷凍管，置室溫融化，在無菌條件下，取0.1mL冷凍菌液至斜面，涂布均勻。于24±1℃恒溫培養箱中培養9～11d，即得母斜面種子。

在母斜面中加入5mL生理鹽水，將菌絲體洗下，攪勻，取0.1mL菌懸液至子斜面，涂布均勻。于24±1℃恒溫培養箱中培養9～11d，即得子斜面種子。

在子斜面中加入5mL無菌蒸餾水，將菌絲體洗下，震蕩均勻，并逐步稀釋到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。

（1）自然篩選

每個稀釋度涂6～10塊平板（￠9cm，加30mL培養基/只），每塊平板加0.1mL菌懸液，涂布均勻后貼上菌種標簽，于24±1℃恒溫培養箱中培養9～11d。

24±1℃培養9～11d后，典型的單菌落具有以下特征：

直徑：1～5mm

形狀：菌落豐滿，有較多皺凸，黃色。

用無菌接種環挑取符合要求的單菌落接種到已配制好的空白斜面培養基上，用"之"型均勻涂布，蓋緊塞子，用一層紗布包扎，并貼上菌種標簽，于24±1℃恒溫培養箱中培養9～11d。

斜面種子質量要求：斜面菌層豐滿，有較多皺凸，黃色，無雜菌。

每支斜面種子做搖瓶考察，生產能力高的埋冷凍管，再做復篩。

（2）紫外篩選

取各稀釋度菌懸液4mL置于培養皿，無菌條件下以紫外燈30cm距離照射30s，照射后的菌懸液涂篩選平板，24±1℃恒溫培養箱中培養9～11d后，挑選單菌落進行篩選。

1.5 分析方法

1.5.1 菌濃測定：

取10mL發酵液離心，4000r/min，15～30min測上清液體積V，計算公式如下：菌濃（％）=（10-V）/10×100％。

1.5.2 總糖測定（DNS法）

（1）水解：取1mL發酵上清液，加入0.2mL 6mol/L的HCl，沸水浴5min，將發酵液中的糖分充分水解成還原糖；

（2）中和：取5mol/L NaOH逐滴加入，用中性pH試紙檢測，顯示中性偏堿即可。

（3）定容：粗略估計發酵液含糖量，用蒸餾水稀釋成相應倍數，待測；

（4）還原糖測定：取帶測樣液1mL（含糖3～4mg），分別置于25mL容量瓶中，各加入DNS試劑2mL，置于沸水浴中煮兩分鐘進行顯色，然后以流水迅速冷卻，用水定容到25mL，搖勻；以空白調零，在540nm處測定吸光度，據標準曲線計算樣品中總糖含量。

1.5.3 美伐他汀測定

1.5.3.1 萃取

方法1：發酵液攪拌均勻，取5mL于250mL三角瓶中，加入20mL甲醇，密封瓶口，震搖15min，靜置5min。

方法2：發酵液攪拌均勻，取10mL于250mL三角瓶中，加入40mL醋酸乙酯，密封瓶口，磁力攪拌2h。

1.5.3.2 稀釋定容

取上清液1mL，用乙腈定容到10mL容量瓶；如有渾濁，HPLC進樣前用膜過濾。

1.5.3.3 HPLC測含量

色譜柱：C18，5u（4.6×250mm）

流動相：CAN：0.1％磷酸（70：30）

檢測器：UV237nm

流速：1.0mL/min

標準溶液：準確稱取美伐他汀標準品，加乙腈溶解，濃度0.1mg/mL左右。

2 結果與討論

2.1 美伐他汀生產菌的選育

以桔青霉NS-3-16為出發菌株，經紫外誘變及平板篩選后，共得121株變異菌株，經搖瓶篩選、復篩，共得27株高產菌株，其中9株MV產量9g/L以上，與出發菌株的對照見表1。

表1 復篩后斜面種子搖瓶考察結果

選出NS-7-04作為進一步研究的試驗菌，NS-7-04菌株的選育譜系圖見圖1。

圖1 NS-7-04菌株的選育譜系圖

2.2 50L發酵罐發酵試驗

在50L自控發酵罐上對NS-7-04菌株發酵過程進行了初步觀察，結果如表2和圖2～圖4。

表2 50L發酵罐發酵試驗

圖2 第一批50L發酵罐發酵全過程

圖3 第二批50L發酵罐發酵全過程

圖4 第三批50L發酵罐發酵全過程

3 結論

（1）以桔青霉NS-3-16為出發菌株，經紫外誘變及平板篩選后，經搖瓶篩選、復篩，選育出高產菌株NS-7-04，與出發菌株NS-3-16相比較，其美伐他汀產率提高了52％。

（2）根據對培養條件的初步研究結果，得出較優培養條件為：培養基初始pH 6.0，培養溫度24℃，每分鐘通風量1：1（體積比），罐壓50kPa，發酵時間9～11d，發酵液中的美伐他汀含量最高可達9.25g/L。傳代試驗表明該菌株產美伐他汀能力和性狀較穩定。

［1］張文琦，胡昌華.美伐他汀產生菌橘青霉原生質體的制備與再生［J］.西南大學學報（自然科學版），2009，31（5）：117-120.

［2］程文娟，楊大鵬，顧豐穎，等.微生物發酵產生他汀類化合物的研究進展［J］.農產品加工（學刊），2011，（2）：76-80.

［3］郄麗萍，張玉蓮，陳麗華，等.美伐他汀產生菌的原生質體誘變育種［J］.河北化工，2007，（4）：32-33.

［4］吳惠芳.他汀類藥物整裝待發［N］.醫藥經濟報，2004-05-24（B2）.

［5］倪文昊.他汀類原料藥出口百花齊放［N］.醫藥經濟報，2005-04-20（C4）.