醬油發酵用2種米曲霉中性蛋白酶的酶學性質比較

王 棟， 馮 杰， 鄭志永， 張麗敏， 詹曉北＊

（1.江南大學 生物工程學院，2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

醬油發酵用2種米曲霉中性蛋白酶的酶學性質比較

王 棟1，2， 馮 杰1，2， 鄭志永1，2， 張麗敏1，2， 詹曉北＊1，2

（1.江南大學 生物工程學院，2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

米曲霉產蛋白酶的性質對醬油品質有重要的影響。研究以一株產中性蛋白酶的米曲霉CICIM F0899為研究對象，首先對其進行掃描電鏡觀察，與米曲霉滬釀3.042比較表明F0899的分生孢子頭較小，分生孢子大于滬釀3.042。其次對F0899和滬釀3.042產蛋白酶酶學性質研究表明F0899產蛋白酶在20～40℃保持穩定，最適反應溫度為60℃，在p H 6.0～8.0時保持穩定，最適反應p H為8.0，在鹽濃度為18%的條件下，仍能保留20%的酶活，可達滬釀3.042的2.2倍，Ag＋對F0899有嚴重的抑制作用，Fe3＋沒有明顯的抑制。因此，米曲霉CICIM F0899產的蛋白酶在耐高溫、耐低p H和耐高鹽的性能優于滬釀3.042。

醬油發酵；大曲；蛋白酶；酶學性質，米曲霉

醬油是傳統調味品，具有悠久的歷史，由于其色澤紅潤香氣濃郁，深受我國、日韓和東南亞各國人民的喜愛［1－4］。米曲霉是醬油釀造中最重要的微生物，菌絲生長迅速，成熟后呈現黃綠色，主要產生蛋白酶，還可以產生淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等。其中，蛋白酶的作用最為重要，米曲霉所產生的蛋白酶產量、種類、活性和穩定性不僅會影響醬油的原料利用率，而且還會影響到醬油的氨基酸組成及風味。目前，在醬油的工業生產中普遍使用米曲霉滬釀3.042［5］。滬釀3.042是1976年由上海市釀造科學研究所通過紫外線誘變和長期馴化得到的優良菌株，具有蛋白酶活力高，分生孢子大，數量多，生長繁殖快，抗雜菌能力強，釀造的醬油風味較好和不產毒素等優點，基本可以滿足醬油釀造的需要［6］。米曲霉CICIM F0899保存于江南大學工業微生物重點實驗室，具有生長迅速，產香氣濃郁和蛋白酶活力高等優點。醬油雖然起源于中國，但是目前在國際上的影響力卻落后于日本，這與菌種和落后的發酵工藝有著密切的關系，因此，尋找優良的發酵菌株并探索出更優的工藝對醬油產品品質的提高具有重要意義，國內外對此都有較多的研究［7－8］。醬油釀造過程中，原料在各種酶系的作用下發生生物和生化反應的過程，通常分為兩個階段：大曲階段和醬醪階段。大曲階段主要是讓米曲霉生長并產生大量的酶，醬醪階段則是原料在各種酶的作用下發生反應的過程［9－10］，蛋白酶的作用方式和作用條件最為關鍵，直接影響醬油品質和原料利用率，醬醪的生理環境具有高鹽、低p H的特點，許多酶的活性和穩定性會受到不利影響［11］，不僅大大延長了發酵周期，而且還降低了原料利用率。因此，尋找一種可以產生耐鹽蛋白酶的米曲霉，不僅可以提高原料利用率、縮短發酵周期，還能提高醬油品質，對醬油產業具有重要的意義。

本文用掃描電鏡技術對米曲霉CICIM F0899和滬釀3.042進行了觀察，并且同滬釀3.042蛋白酶的性質進行了比較，研究了溫度、p H、鹽度和金屬離子對蛋白酶活力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉CICIM F0899（以下簡稱F0899）保存于江南大學工業微生物菌種保藏中心；米曲霉滬釀3.042保存于江南大學生化工程與生物反應器研究室；干酪素（化學純）、福林酚、戊二醛、醋酸異戊酯、四氧化鋨等（均為分析純）上海生化試劑公司。

1.2 儀器與設備

3K15高速冷凍離心機：德國Sigma產品；MAPADA UV－1800分光光度計：上海美譜達產品；CPD－030臨界點干燥儀：瑞士BAL－TEC公司產品；SCD－005離子濺射儀：瑞士BAL－TEC公司產品；QUANTA－200掃描電鏡：荷蘭FEI公司產品。

1.3 菌種活化培養

將保存的米曲霉菌種接種于PDA固體培養基中，置30℃培養48 h，活化后備用。

1.4 電子掃描電鏡觀察

將培養48 h的米曲霉，用刀片切取一小塊，在體積分數5%的戊二醛中固定4 h，然后用0.1 mol／L的磷酸緩沖液漂洗數次，過夜4℃保存，直到將戊二醛洗凈。再用質量分數1%四氧化鋨固定，并用0.1 mol／L的磷酸緩沖液漂洗數次，4℃保存。洗凈樣品之后，分別用體積分數30%、50%、70%的乙醇梯度脫水，再加入無水乙醇脫水兩次。室溫下分別加入乙醇：醋酸異戊酯為2∶1的溶液2 m L，放置5 min，吸出原溶液，再加入乙醇：醋酸異戊酯為1∶2的溶液2 m L。5 min后吸出原溶液，加入純的醋酸異戊酯，洗兩遍。之后進行臨界點干燥，離子濺射，最后用掃描電鏡觀察。

1.5 制曲方法

將豆粕、炒麥和拌料水按照質量比為：1.1∶0.9∶2混勻后，經過121℃，30 min滅菌處理。以質量分數1%接種量接入培養好的種曲，控制曲料品溫在30℃，培養48 h，取樣測定大曲蛋白酶酶活。

1.6 大曲蛋白酶提取方法

向取出的大曲曲樣中加入1∶20（g∶m L）的0.1 mol／L，p H 值為7.2的Na2HPO4－Na H2PO4緩沖溶液，于40℃水浴中，間歇攪拌，浸提1 h，濾紙過濾得蛋白酶酶液。

1.7 蛋白酶活測定方法

采用改進的福林酚法［12］。大曲蛋白酶活定義為1 g干質量大曲中所含的蛋白酶在40℃，p H值7.2條件下每1 min水解干酪素產生1μg酪氨酸為1個酶活力單位（U）。

1.8 蛋白酶產生過程曲線

將種曲接入配制好的大曲培養基中，置于30℃條件下靜置培養，分別在12、18、24、30、36、42和48 h取樣測定大曲的蛋白酶活，繪制蛋白酶活隨時間的變化曲線。

1.9 溫度對蛋白酶活性的影響

將酶液分別于20～70℃下反應，測定酶活，以溫度為橫坐標，最大酶活為100%，以殘余酶活為縱坐標，繪制曲線。為測定蛋白酶的溫度穩定性，將酶液置于20～70℃條件下處理30 min，再在最適條件下測定酶活，以最大酶活為100%，繪制曲線。

1.10 pH值對蛋白酶活性的影響

將酶液分別于p H 值3.0～10.0（p H 值3.0～5.0 用 Tris－HCl 緩 沖 液；p H 值 5.0～8.0 用Na2HPO4－Na H2PO4緩 沖 液；p H 值8.0～10.0用Tris－NaOH緩沖液）的條件下反應，測定酶活，以p H值為橫坐標，最大酶活為100%，以殘余酶活為縱坐標，繪制曲線。為考察蛋白酶的p H值穩定性，將酶液置于p H值3.0～10.0的緩沖液中，于25℃處理12 h，再在最適條件下測定酶活，以p H值為橫坐標，最大酶活為100%，以殘余酶活為縱坐標，繪制曲線。

1.11 NaCl對蛋白酶活性的影響

將酶液置于不同濃度的NaCl溶液中測定酶活，以鹽度為橫坐標，最大酶活為100%，以殘余酶活為縱坐標，繪制曲線。將酶液放置于18 g／d L的NaCl溶液中，保存在4℃條件下，每兩天測定一次酶活，觀察蛋白酶在高鹽條件下的穩定性，以天數為橫坐標，最大酶活為100%，以殘余酶活為縱坐標，繪制曲線。

1.12 金屬離子對蛋白酶活性的影響

向酶液中加入 Ag NO3、AlCl3、CaCl2、CoCl2、CuSO4、Fe2（SO4）3、MgSO4，MnSO4和ZnSO4至終濃度為5 mmol／L，于25℃靜置30 min，測定酶活，并以空白對照為100%，計算剩余酶活。

2 結果與分析

不同微生物的產酶特性存在著差異，往往可以通過細胞形態和酶學性質反映出來，以下通過掃描電鏡觀察的方法，考察了兩株米曲霉之間的形態差異，并且比較了兩者蛋白酶在溫度、p H、鹽度和金屬離子方面的異同。

2.1 掃描電鏡結果

為了研究F0899同滬釀3.042在微觀形態上的差異，采用掃描電鏡技術對二者進行了分析（見圖1）。

圖1 米曲霉滬釀3.042和F0899掃描電鏡照片比較Fig.1 SEM images of Aspergillus oryzae 3.042 and F0899

從圖1可以看出，F0899的分生孢子頭呈放射形，直徑44.9～53.1μm，比滬釀3.042的分生孢子頭小，滬釀3.042的分生孢子頭直徑通常在43.5～67.8μm。兩者的分生孢子都呈現近似橢圓形，表面粗糙，F0899的分生孢子明顯大于滬釀3.042，長軸約為4.5～6.2μm，短軸約為3.6～5.2μm，而滬釀3.042的分生孢子長軸約為3.6～4.3μm，短軸約為3.1～4.0μm。

2.2 蛋白酶產生過程曲線

掌握米曲霉生長和產酶的過程可以為發酵過程控制提供依據。在接入種曲后，分別于12、18、24、30、36、42 h和48 h取樣測定大曲的蛋白酶活，得到了大曲蛋白酶活隨時間的變化曲線。

圖2 米曲霉滬釀3.042和F0899大曲蛋白酶產生過程Fig.2 Protease production in koji of Aspergillu oryzae 3.042 and F0899

由圖2可知，米曲霉滬釀3.042和F0899的蛋白酶產生都主要集中在18～30 h，蛋白酶活在36 h時達到最大，F0899的蛋白酶活力可達到1 933 U／g（干基），滬釀3.042的蛋白酶活力達到1887 U／g（干基），并且都隨著培養時間的延長酶活緩慢下降，F0899的大曲蛋白酶活在18～24 h間迅速增加，明顯超過了滬釀3.042的產酶速度，說明菌株F0899的生長和產酶速度明顯優于滬釀3.042。

2.3 最適反應溫度和酶的熱穩定性

溫度是醬醪發酵中重要的影響因素，通過影響蛋白酶的活性和穩定性進而影響到醬油的產率和品質，因此，了解蛋白酶的性質是采取合適工藝的基礎。

圖3 溫度對蛋白酶活性和穩定性的影響（（a）最適反應溫度 （b）熱穩定性）Fig.3 Temperature effect to protease activity and stability（（a）optimum temperature（b）temperature stability）

由圖3（a）可知，米曲霉滬釀3.042的蛋白酶活性隨溫度的升高而增加，在50℃達到最大值，當溫度繼續升高，蛋白酶開始加速失活，當溫度達到70℃時，蛋白酶活力僅剩余80%。米曲霉F0899的蛋白酶活性也隨溫度的升高而增加，在60℃時達到最大值。還可以看出，米曲霉F0899的蛋白酶活力在低溫時明顯高于滬釀3.042，并且對高溫有著更好的耐受性。鄧靖研究了米曲霉M3的中性蛋白酶性質，發現該酶的最適反應溫度為50℃，并且在40℃以下保持穩定［13］。

由圖3（b）可知，米曲霉滬釀3.042和F0899的蛋白酶在低于40℃，保持30 min條件下具有良好的熱穩定性，在50℃時，F0899蛋白酶的熱穩定性明顯高于滬釀3.042，當溫度繼續升高，蛋白酶則加速失活。米曲霉KFRI888的中性蛋白酶在50℃以上時穩定性明顯下降［14］。湯鳴強對米曲霉F－81的中性蛋白酶進行了研究，發現在40℃以下時，酶的穩定性良好，在60℃處理20 min，酶幾乎完全失活［15］。

2.4 最適反應p H和p H穩定性

p H值對酶活性和穩定性具有重要的影響，反應體系p H值的變化，會影響酶活性部位的基團解離狀態，從而影響酶的活性。極端的p H值會使維護酶三維結構的許多非共價鍵受到干擾，導致酶自身的變性。

圖4 pH對蛋白酶活性和穩定性的影響（（a）最適反應p H（b）p H穩定性）Fig.4 pH effect to protease activity and stability（（a）optimum pH（b）p H stability）

由圖4（a）可知，米曲霉滬釀3.042和F0899的蛋白酶最適反應p H值在6.0～8.0，酶活隨p H值的下降而迅速下降，當p H值到達4.0時，酶活僅剩余20%左右。當p H到達10.0時，酶活僅剩余40%左右，兩株菌的蛋白酶都屬于中性蛋白酶。

由圖4（b）可知，米曲霉滬釀3.042和F0899的蛋白酶在p H值為5.0～9.0的范圍內保持穩定，隨著p H值的下降，酶活的穩定性下降，當p H值達到3.0時，酶活僅剩余30%，還可以看出F0899的蛋白酶在p H值4.0時，穩定性明顯高于滬釀3.042，剩余酶活可達到65%，而滬釀3.042僅為40%。

酶的作用依賴于合適的p H值環境，如酸性蛋白酶活性隨著p H值升高而下降，中性蛋白酶發揮作用通常最好在中性或偏堿性條件下［16］。李艷麗發現米曲霉ZW－06的中性蛋白酶在p H值6.0～10.0的環境下都能保持較高的穩定性［17］。

2.5 NaCl濃度對蛋白酶活性的影響

高鹽稀態醬醪發酵是將18～25 g／d L的鹽水加入成曲后，進行發酵的過程，通常鹽度保持在18 g／d L以上。高鹽環境會使酶表面的帶電荷情況發生改變，從而引起酶的構象變化，導致酶與底物的結合能力發生改變，最終影響到酶的催化性能。因此，在高鹽環境下蛋白酶的活力受到嚴重抑制，影響了原料的降解速度和利用率，不僅延長發酵周期，而且降低醬油的品質。篩選獲得高耐鹽蛋白酶成為解決高鹽發酵的關鍵，對醬油產業的發展具有重要的意義。

由圖5（a）可知，滬釀3.042和F0899的蛋白酶活性隨著鹽度的升高而逐漸下降，這與許多學者的研究結果一致［16－19］。但是，當 NaCl濃度達到18 mg／d L時，滬釀3.042蛋白酶酶活僅剩余9%而F0899蛋白酶活性高達20%，為前者的2.2倍。F0899的蛋白酶活力在高鹽條件下明顯好于滬釀3.042，在醬油生產中將具有更加明顯的優勢。由圖5（b）可以看出，NaCl濃度對蛋白酶活力的穩定性沒有太大影響，到第14d時，滬釀3.042和F0899的蛋白酶活仍可保留70%和75%。

2.6 金屬離子對蛋白酶活性的影響

金屬離子會和酶的活性中心發生作用，進而影響酶的活力，實驗考察了一些常見的金屬離子對滬釀3.042和F0899的蛋白酶活力的影響。

圖5 氯化鈉對蛋白酶活性的影響（（a）最適反應鹽度 （b）鹽度穩定性）Fig.5 NaCl effect to protease activity（（a）optimum NaCl concentration（b）NaCl concentration stability）

圖6 不同金屬離子對蛋白酶活性的影響Fig .6 Metal ions effect to protease activity

從圖6可以看出，Mn2＋和Cu2＋對蛋白酶有輕微的促進作用，Li＋、Ca2＋、Co2＋、Mg2＋、Zn2＋對蛋白酶也均有輕微的抑制作用，而Ag＋對滬釀3.042和F0899的蛋白酶都有嚴重的抑制作用，酶活僅能剩余24%和33%。Al3＋對蛋白酶也有較為明顯的抑制作用，酶活剩余63%和43%。而Fe3＋對兩者的抑制作用明顯不同，對滬釀3.042的蛋白酶具有較強的抑制作用，酶活僅剩余44%，這與鄧靖［13］、湯鳴強［15］所報道的米曲霉中性蛋白酶受到Fe3＋的強烈抑制相一致。對F0899的蛋白酶幾乎沒有明顯的抑制，酶活可剩余89%。

3 結語

本實驗對一株可以產生耐高鹽蛋白酶的米曲霉菌株CICIM F0899進行了研究，并和在生產中廣泛應用的米曲霉滬釀3.042進行了比較。得到以下結論：

（1）米曲霉F0899的分生孢子頭較小，而分生孢子明顯大于滬釀3.042；

（2）米曲霉F0899及滬釀3.042產蛋白酶主要集中在18～30 h，而且蛋白酶的分泌速度明顯高于滬釀3.042；均在40℃以下保持穩定，最適反應溫度分別為50℃和60℃；在p H值6.0～8.0保持穩定，最適反應p H值分別為8.0和7.0；

（3）米曲霉F0899及滬釀3.042的蛋白酶活性隨著鹽濃度的增加而下降，米曲霉F0899蛋白酶的耐鹽性明顯高于3.042，在18 g／d L NaCl濃度下酶活仍保留20%，而3.042僅剩余9%；

（4）Ag＋對米曲霉F0899及滬釀3.042的蛋白酶都有嚴重的抑制作用，Fe3＋對兩者的抑制作用明顯不同，對F0899的蛋白酶幾乎沒有明顯的抑制，酶活可達到89%，對3.042的蛋白酶具有較強的抑制作用，酶活僅剩余44%。

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Characteristic Comparison of Two Neutral Proteases Used for Soy Sauce Fermentation

WANG Dong1，2，FENG Jie1，2，ZHENG Zhi－yong1，2，ZHANG Li－min1，2，ZHAN Xiao－bei＊1，2

（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Wuxi 214122，China）

The characterization of protease from Aspergillus oryzae has a significant impact on soy sauce quality.In this study，an Aspergillus oryzae CICIM F0899 capable of producing neutral protease was investigated.Morphology of Aspergillus oryzae F0899 and Aspergillus oryzae 3.042 were imaged by SEM.The conidial head of Aspergillus oryzae F0899 was relatively smaller than that of the strain 3.042.Its conidia were larger than that of the 3.042 strain.In addition，properties of the protease secreted by this strain were tested and compared with profiles of an industrially strain Aspergillus oryzae 3.042.The results showed that the optimum temperature for the extracellular protease from F0899 was 60℃，with the stable temperature range between 20～40℃.The optimal pH was 8.0，with the stable pH range between 6.0～8.0.It could tolerate 18%sodium chloride and still retains 20%activity，which is as high as 2.2 times than that from 3.042 under the same condition.The activity of the enzyme was severely inhibited by Ag＋，but affected by Fe3＋only slightly.Therefore，protease from Aspergillus oryzae F0899 can bear higher temperature，lower pH and higher NaCl concentration than that from 3.042.

soy sauce production，koji，protease，enzymatic properties，Aspergillus oryzae

＊

詹曉北（1962－），男，北京人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事發酵工學與生化工程研究。E－mail：xbzhan＠yahoo.com

Q 819

A

1673－1689（2012）05－0479－07

2011－06－16

國家“十一五”科技支撐計劃項目（2008BAI63B06，2007BAK36B03），國家“十二五”科技支撐計劃項目（2011BAD23B04）.

王棟（1982－），男，河南三門峽人，博士研究生，主要從事發酵工程學研究。