抗凍蛋白在食品中應用研究進展及安全性分析

張 暉， 丁香麗

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

抗凍蛋白在食品中應用研究進展及安全性分析

張 暉， 丁香麗

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

抗凍蛋白是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質類化合物的總稱，具有降低冰點、修飾冰晶形態、抑制重結晶等特性。對抗凍蛋白在食品原料生產及加工和貯藏中的應用研究進展進行簡要的概述并對其安全性進行了簡單分析，以期為抗凍蛋白在食品領域的應用提供參考。

抗凍蛋白；食品；應用；轉基因；安全

抗凍蛋白（antifreeze protein，AFPs）亦稱熱滯蛋白（thermal hysteresis proteins，THPs）或冰結構蛋白（ice structuring proteins，ISPs），是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質類化合物的總稱。19世紀60年代由Devries首次從南極魚類的血液中發現，現已證明AFPs普遍存在于魚類、植物、昆蟲、細菌和真菌中［1－2］。AFPs具有非依數性的降低冰點，改變冰晶形態和抑制重結晶等主要特性，使其具有潛在的商業價值和廣泛的應用前景。2006年，中國衛生部已將ISPs列為可用于冷凍食品中的新型食品添加劑［3］。本文擬對AFPs在食品原料生產及加工和貯藏中的應用進行綜述，并對存在的安全問題進行分析，以期為AFPs在食品領域的應用提供參考。

1 在食品原料生產中的應用

低溫及寒冷是影響果樹、蔬菜作物和水產品生產的一種逆境因素，也是某些農作物區域性和季節性的限定因素。通過基因工程將AFPs的基因轉入到原來沒有AFPs的動植物體內，使其產生AFPs，不僅能增強其抗寒能力，實現不同地區動植物的轉移培養，而且可以改善速凍產品在解凍過程中常出現的汁液流汁、軟爛，失去原有形態的問題，提高速凍品質量［4］。雖然AFPs在動植物中均存在，到目前為止，只有魚類AFPs基因的結構、表達調控機制有了系統的研究，因此通過AFPs基因改變動植物抗凍性的工作只限于魚類AFPs。

Fletcher，G.L.等［5］將美洲擬鰈（Pseudopleuronectes americanus）血淋巴AFPs直接注射入虹鱒魚（Salmo gairdneri）體內，發現可在凍結溫度下提供有效的保護。Davies等［6－7］將冬季牙鲆的AFP的線性DNA經顯微注射轉入大西洋鮭的受精卵。通過PCR和Southern印跡分析和AFP活性檢測，表明AFP基因已成功轉入并整合到鮭魚基因組，在部分轉基因魚的F3代有AFP的持續表達，且檢測到了AFP的活性。成功的實例還包括：，羅非魚，遮目魚等。李晶等［8］將AFPs的基因轉移到熱帶羅非魚（Oreochromis massambicus）中，發現轉基因魚對低溫有一定的抵抗能力，為在北方自然水域中培育羅非魚提供了可能性。朱新平等［9］采用顯微注射的方法將美洲大綿鳚（Macrozoaces americanus）的抗凍蛋白基因轉入鯪魚（Cirrhina molitorella），獲得轉抗凍蛋白基因鯪魚。

Cutler等［10］使用AFPs基因真空滲潤馬鈴薯、油菜、擬南芥的葉片，證明AFPs可使這些葉片的凍結溫度顯著降低；懸浮培養暴露在AFPs中的雀麥，可降低在任何給定溫度下可結冰水的凍結，證實了轉AFPs基因可提高植物的抗寒性。李天然等［11］將AFPs的3種抗凍肽基因分別轉入甜菜中獲得轉基因工程植株，通過抗寒性試驗，甜菜可耐－6.5℃的低溫。

Geroges等［12］合成了冬鰈AFPs基因，用電擊法轉入到玉米原生質體中，通過CAT活性、Western雜交及免疫學檢測，證實AFPs與CAT構成的錢和基因已經在玉米原生質體中表達。Niklas等［13］經過RT－PCR技術，在轉基因馬鈴薯中檢測到了轉錄的AFPs基因，在含有AFPs的組織提取液中，檢測到了重結晶抑制效應。Khanna，H.K.等［14］將合成的重組美洲擬鰈 HPLC－6α－螺旋 AFPs基因在春小麥中進行表達，轉基因春小麥表現出了最高的抗凍活性，在－7℃下具有顯著的冷凍保護作用。

Hightower等［15］將極區魚的Cafa3AFPs基因轉化并獲得轉基因煙草和番茄，在含有融合蛋白的組織中檢測到了重結晶抑制作用。Mueller等［16］將合成的AFPs基因，采用葉盤法轉化番茄，檢測的轉化植株的AFPs的表達量約占葉片中可溶性蛋白的0.1%，并表現出重結晶抑制活力。黃永芬等［17］將整合在Ti質粒上的afp基因作為供體DNA，用花粉管通道和子房注射方法導入番茄品種“中蔬四號”中，田間抗寒性研究表明轉基因組植株生長勢優于對照，表現了一定的抗寒能力。轉基因各組的致死溫度降低1～2℃，耐低溫時間也明顯延長。孫瑞芬等［18］以不同草莓品種葉柄基部為轉化起始材料，通過農桿菌介導，獲得了AFPs基因轉化草莓的小植株，通過PCR擴增目的基因檢測和離體葉片抗凍實驗，證明AFP基因導入草莓基因組后，明顯提高了植株的抗凍能力。

Panadero等［19］將來源于極地魚grubby sculpin（Myoxocephalus aenaeus）的重組抗凍肽 GS－5在實驗室和工業面包酵母菌株（釀酒酵母）中進行異源表達，產生的重組蛋白提高了所有試樣的耐凍性。而且，GS－5編碼基因的表達顯著提高了冷凍面團和冷凍甜面團的產氣率和總產氣量。

2 在食品加工和貯藏中的應用

AFPs通過直接混合、浸泡、真空滲透等物理手段添加到食品中，可降低貯藏溫度，減小冰晶形成和重結晶對冷凍食品質構的破壞，改善食品品質，延長貨架期。

將AFPs直接作為食品添加劑，加人到香檳酒中，能夠消除冰渣，改善質量和口味，低溫貯藏后只有很少甚至沒有冰晶生成，而不加AFPs的對照組卻有大量冰晶生成［20］。

在水產品冷凍加工的過程中，如冷凍魚糜，加入一定量的AFPs就能夠減緩冷凍速度，形成均勻的小冰晶，防止魚肉蛋白質變性引起的肉質持水能力下降，提高產品質量［21］。

Payne等［22］研究了南極鱈魚和美洲擬鰈AFPs對冷卻肉和冷凍肉的作用。SEM研究表明，與空白相比添加AFPs能夠減小冰晶的大小，減小的程度與冷凍前浸泡AFPs的濃度和浸泡時間相關。Payne等［23］還研究了屠宰前將抗凍糖蛋白（AFGP）注射到羊羔體內對凍融后羊肉的影響。通過解凍時的汁液損失及感官品質及部分冷凍樣品冰升華后掃描電鏡發現宰前1～24 h注射AFGP能夠降低汁液的流失和減小冰晶大小，終濃度0.01μg／kg時，羊羔肌肉中所形成的冰晶達到最小。

日本Kansai大學生物技術系的Hidehisa Kawahara領導的研究小組用根部吸收了從公魚中提取出來的AFPs的櫻桃番茄進行了一項實驗。研究人員將櫻桃番茄在－20℃條件下冷凍10 d后解凍，他們發現櫻桃番茄與沒有吸收AFPs的普通櫻桃番茄相比，更加新鮮，變性也小［24］。

Cruz等［25］將AFPⅠ通過真空浸漬法注入西洋菜中，通過Hunter Lab色差、掃描電鏡及萎蔫度測試研究了對冷凍西洋菜的影響，結果表明，58KPa下5 min能夠將AFP－I真空浸漬到西洋菜中，與空白組比真空浸漬AFP－I的樣品細胞壁有更好的清晰度，更圓潤的細胞形狀，添加AFP－I的葉子比對照組有更高的膨脹壓，證實AFPⅠ是一種有效的添加劑。

Kontogiorgos等［26－27］從冷誘導的冬麥草非原質體提取物中分離得到了一種熱穩定的奇異果甜蛋白屬ISP，并研究了其對冷凍面團超微結構的影響。發現空白面團在溫度波動條件下凍藏30 d，會破壞面筋結構。而加入0.1%ISP，可以減緩在冰重結晶階段面筋－冰復合物的結構變化，使面筋網絡中空洞相對變小，進而保護面筋結構。張超等［28－30］將胡蘿卜抗凍蛋白（Dc AFP）添加到冷凍面團中，研究了Dc AFP對冷凍面團發酵能力、質構和風味的影響。通過感官評定、差示掃描量熱儀、質構分析儀及固相微萃取－氣質聯用對冷凍面團貯藏過程中可凍結水含量、及面包質構品質和香氣成分進行了分析，發現添加Dc AFP后酵母的死亡率明顯降低，面團發酵能力增強，面團流變學特性提高，證明在凍藏過程中加入Dc AFP能夠降低可凍結水含量，保護酵母細胞，提高面團發酵能力，減小面包硬度，增加面包比容，烘烤后的面包中還引入了類似于十里香的宜人香氣。

潘振興等［31］采用冷凍面團烘焙發酵法研究了冷凍保護劑對冷凍面團發酵與烘焙特性的影響，發現ISP預處理可以有效提高酵母冷凍存活率及產氣力，顯著縮短冷凍面團的醒發時間，增大面包比容，降低面包硬度，有效保護冷凍面團超微結構。強化0.5%ISP的面團體系的超微結構可以得到有效保護，可以顯著提高冷凍面團的抗凍發酵特性。

夏露等［32］將冬小麥麩皮AFPs粗品以不同的添加量添加到湯圓中，通過對湯圓的質構、外觀、湯圓湯的濁度等因素的測定考察冬小麥麩皮AFPs對湯圓儲存期間品質變化的影響。加入AFPs后湯圓的硬度減弱，彈性值增加。在－60℃下速凍24 h后，未添加冬小麥麩皮AFPs的湯圓出現開裂現象，而添加AFP的湯圓則呈現較光滑的外觀，煮熟后渾湯清晰透明，易被人們所接受。證明添加2.5%的冬小麥麩皮AFPs能明顯改善湯圓品質。

據報道，美國的DNAP公司將AFPs添加于冰淇淋和冰奶中，消除了冰渣，改善了質量和口味。把少量的AFPs加入到已融化的冰淇淋樣品中，于－80℃下迅速冷凍，在－6～－8℃下放置1 h后，用顯微鏡觀察重結晶的變化，發現同對照相比，冰晶明顯變小。Tomorrow Products（Los Angeles，CA）生產的Eskimo品牌的Twin Pop（香蕉口味），在－6～－8℃下放置1 h后，對照樣品有顯著的大冰晶，而添加AFPs的樣品觀察不到冰晶生長。Merrit Foods（Kansas City，MO）生產的外覆根啤酒外殼的香草冰淇淋經1h的貯藏，添加AFPs的樣品只有非常少的冰晶生成，而對照樣品卻有明顯的冰晶增長［33］。

Daniel等［34］將AFP添加到冷凍甜食中，研究AFP對冷凍甜食網絡結構、機械性能、硬度及風味、色澤保持的影響。研究表明，將AFP添加到冷凍乳品如冰奶、冷凍酸奶（frozen yoghurt）、軟香乳凍（frozen custard）、充氣／不充氣冰凍果子露（aerated and unaerated sherbet）以及充氣或不充氣的不含奶的冷凍甜食，如冰糕或冰沙（sorbet）、格蘭尼它冰糕（granitas）、冷凍果漿（frozen fruit purees）中，能夠形成一種牢固的、密集的連續網絡結構，使冷凍甜品的品質得到顯著的改善。在未充氣冰淇淋中添加AFP Type III HPLC 12，通過四點彎曲測試測定其表面彈性模數和抗彎強度，證明其至少有0.2的接觸度，具有低于－150 mm.Sup.－2的龐加萊（Euler－Poincare）特 性；通 過 維 氏 硬 度 試 驗 （Vickers Hardness）證明產品的硬度得到了提高。實驗證明在生產具有特殊形狀的冰糕時，未添加AFP時脫模發生斷裂，而添加AFP后能夠完整的脫模到一張紙上，即使是尖銳的部分也不會斷裂。以溶質或分散相的方式加入冷凍甜食中能夠控制風味、色澤、離子或大分子流失。由于各層之間的風味不會發生流失和融合，所以能夠生產每層具有不同風味的多層產品。對樣品拍照發現，含AFP的樣品在－10℃保存7周后只有少量或幾乎沒有顏色的轉移，而未添加AFP的樣品在－10℃保存1周后開始出現顏色的轉移，7周后整個樣品成了單一的混合顏色。

Regand等［35－36］將冷誘導冬麥草水提物（AWWE）添加到冰淇淋中，在總蛋白添加量0.003%時通過亮視野顯微技術觀察到顯著的ISP活性。在－18℃和溫度波動條件下貯藏一個月，通過感官評定發現溫度波動組冰淇淋口感明顯比空白組滑膩，證實添加ISP能夠顯著降低冰晶生長。在熱激處理冰淇林中，添加蛋白總量0.0025%和0.0037%的AWWE，能分別降低冰晶重結晶速率的44%和46%，且巴氏殺菌前添加到混合物中并不影響其ISP活性。當添加量為0.13%時，重結晶抑制效果達到平衡。通過冷凍掃描電鏡（Cro－SEM）觀察發現，當添加量為高濃度時，由于冰晶體形態學的改變形成了非常粗糙、片狀的冰淇淋。

3 食品中應用的安全性分析

一種蛋白應用于食品中之前，必須評估它潛在的致敏性。科學家已經對AFPs在食品中應用的安全性和可行性進行過評估，認為AFP本身既無毒性，其功能特性也不與任何毒性蛋白相關聯。聯合利華的ISP Type III HPLC 12制劑已經在澳大利亞、新西蘭、智利、印度尼西亞、墨西哥、美國以及菲律賓在當地監管規程下得到了授權。從2003年到2007年，在美國銷售了大于47千萬含ISP的食用冰產品，在澳大利亞／新西蘭約4萬7千升含ISP的冰淇林，無安全事件報道［37］。

R.Crevel，Fedyk等［38］認為，在美國食物中含有的AFPs約1～10 mg／d，在冰島達50～500 mg／d。因此AFPs可被食用并沒有長期或短期的不良健康影響。結合AFPs的結構多樣性，從AFPs消費歷史可以得到一個確定的結論－它們的功能特性并不會產生任何顯著的毒理學作用，尤其是對消費數據已知的魚類AFPs，推斷出其缺乏致敏性是合理的。

Baderschneider B等［39］測定了重組面包酵母發酵生產的ISP TypeⅢHPLC 12及其糖復合物與已知致敏性蛋白氨基酸序列的相似性及抗胃蛋白酶水解性。結果表明，重組面包酵母發酵生產的ISP TypeⅢHPLC 12及其糖復合物與已知致敏性蛋白的氨基酸序列無相似性，在p H 1.5時10min內50%能夠被降解為小片段而不能產生致敏性或引發與IgE的交聯。隨后的研究證明，對魚過敏個體的IgE并不結合ISP TypeⅢ，得出ISP TypeⅢHPLC 12及其糖復合物不可能具有潛在致命危害的結論。

Bindslev J等［40］采用 WHO／FAO最新提出的決策體系來探討北極魚源（美洲大綿鳚、大洋鱈魚）ISP潛在致敏性。方法包括對已知過敏原序列相似度的氨基酸序列分析、在標準化條件下的可降解性以及特定IgE與蛋白的結合和人類粒細胞中組胺的釋放。表明該ISP與已知致敏物無序列相似性且在標準化條件下對蛋白酶水解具有不穩定性。采用20位有魚敏感病史，對美洲大綿鳚、凍綿鮪魚和鰻魚皮膚點刺實驗呈陽性的患者血清，證實了對相同魚證明了ISP對魚敏感的患者及其他對可引起IgE響應蛋白敏感的個體的安全性。

Poulsen［41］依據決策樹方法的加權風險分析代替預測性分析，包括已知過敏原的序列同序性、特定IgE對已知過敏原的交叉反應的血清篩選、蛋白在模擬胃或腸液中的可消化性及動物實驗。在大于5個連續氨基酸序列的致敏物中沒有發現同序性，20個魚過敏史、皮膚點刺測試呈陽性的的病人血清對同源魚提取物均表現出體外IgE結合活性，體外血清實驗中引起的組胺釋放，而ISP在同樣條件下的所有試驗中呈陰性。ISP可被胃蛋白酶在10 min內降解為小片段。因此，ISP與已知魚致敏物無交叉反應，也不會成為一種敏化蛋白。

Hall－Manning T 等［42］通過一系列體內和體外基因毒性測定（細菌誘變、染色體畸變、哺乳動物基因突變和小鼠骨髓微核）以及為期3個月的重復高劑量的飼喂小鼠重組面包酵母產生的ISP TypeⅢHPLC 12制劑得到的數據表明，小鼠以580 mg／kg／d（無明顯副作用的最高劑量）口腔服用ISP TypeⅢHPLC－12 3個月沒有得到表明潛在基因毒性（采用方法中可接受的極限濃度）或顯著的亞慢性毒性的數據。

R.W.R.Crevel等通過健康受試志愿者每周5 d分別攝入ISP－Ⅲ制劑或安撫劑達8個周，在這個過程中，記錄常規健康指標，監控ISP－Ⅲ特定的IgG和IgE抗體水平評估其免疫原性。在測試及后續4周的隨訪期間，受試者血液中無ISP－Ⅲ特定的IgG和IgE抗體檢出。強免疫原性蛋白會產生的響應的缺失與前人的研究結果一致，證實了ISP－Ⅲ制劑沒有免疫原性［43］。因此，專家組認為這些不良反應在攝入含ISP的產品后不會出現，嚴格按照質量指標和生產工藝所描述在冰產品生產中使用相當于0.01%ISP type III HPLC 12制劑的最大劑量是安全的［37］。

但是，并不是所有用來評估致敏性的測試都有可靠的科學依據。環保激進分子、宗教團體、公益性團體、行業協會以及其他科學家及政府官員認為單盲安慰劑對照試驗有很多不足之處，許多重要的問題未得到解決：①該實驗只包括少數健康志愿者，其中實驗組23個，對照組9個。②采用的制劑是包含酵母蛋白和糖的聚合物的未純化ISP，而這些會使免疫反應變得復雜。③受試時間太短可能不足以充分顯示ISP潛在的免疫性。④ISP制劑是通過一種調味飲料口服給受試者而非通過準備應用到其中的冰淇林，引起的免疫反應是有區別的。另外，即使口服不會引起免疫反應，潰瘍、擦傷、切口或以冰淇林粉塵的形式通過呼吸道吸入等途徑的動物試驗無相關報道。聯合利華和2006年Food Standards Australia ＆New Zealand的報告均以ISP的單克隆抗體做為分析方法來描述試驗，表明ISP本身是免疫原性的。ACNFP認為在評估ISP制劑潛在致敏性時使用鱈魚敏感個體對魚過敏人群具有代表性，該結論是不合理和不科學的，因為鱈魚過敏癥是由小清蛋白引起的，而ISP與小清蛋白無關且無相似性。在鱈魚過敏人群中進行ISP的致敏性研究沒有任何意義。委員會關于標簽中注明產品中含有的ISP制劑是從酵母中獲得的還不夠，需要注明是從轉基因酵母中獲得的［44］。

4 展望

目前AFPs在食品領域還未得到廣泛的應用中，一個原因是獲得AFPs的成本和復雜工藝的限制，另一個原因是AFPs并不能納入到標準混合工藝中，因為在加工過程尤其是巴氏殺菌過程中AFPs會由于變性變的不穩定。雖然抗凍糖蛋白和冬季比目魚的I型抗凍蛋白已商業化生產，但產品主要用于研究或某些特殊領域［45］。食品及保健行業巨頭－聯合利華已有含ISPs的產品出售，但是它們的ISPs是通過轉基因酵母菌生產的，因此受到了一些反對轉基因技術組織的關注。盡管近年來對AFPs研究越來越充分，但仍有很多需要研究的課題，尤其是開發新型高活性AFPs或通過分子生物學的手段提高蛋白含量；快速準確測定AFPs活性實驗方法的建立；AFPs的合成及類似物、模擬物的應用；在食品體系中與冰、水、蛋白質及其他物質的相互作用以及進一步的安全性評價等［46－48］。

（References）：

［1］熊小文，黃發泉，黎毛毛，等.植物抗凍蛋白研究進展［J］.江西農業學報，2009，21（10）：112－114.

XIONG Xiao－wen，HUANG Fa－quan，LI Mao－mao，et al.Research advances in plant antifreeze protein［J］.Acta Agriculturae Jiangxi，2009，21（10）：112－114.（in Chinese）

［2］Crevel R W R，Fedyk J K，Spurgeon M.J.Antifreeze proteins：characteristics，occurrence and human exposure［J］.Food and Chemical Toxicology，2002，40（7）：899－903.

［3］劉晨臨，黃曉航.抗凍蛋白的研究及其在生物技術中的應用［J］.海洋科學進展2002，20（003）：102－109.

LIU Chen－lin，HUANG Xiao－hang，LI Guang－you.Advandes in antifreeze protein research and its application in biotechnology［J］.Advances in Marine Science，2002，20（003）：102－109.（in Chinese）

［4］代煥琴，郭索娟.抗凍蛋白及其在食品工業中的應用［J］.食品與發酵工業，2001，27（012）：44－49.

DAI Huan－qin，GUO Su－juan，LU Cunfu.Antifreeze proteins and their application in food industry［J］.Food and Fermentation Industries，2001，27（012）：44－49.（in Chinese）

［5］Fletcher G L，Kao M H，Fourney R M.Antifreeze peptides confer freezing resistance to fish［J］.Canadian Journal of Zoology，1986，64（9）：1897－1901.

［6］Fletcher G L，Shears M A，King M J，et al.Evidence for antifreeze protein gene transfer in atlantic salmon（salmo salar）［J］.Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences，1988，45（2）：352－357.

［7］Hew C，Fletcher G，Davies P.Transgenic salmon：Tailoring the genome for food production［J］.Journal of Fish Biology，1995，47：1－19.

［8］李晶，李榮萍.低溫對轉抗凍蛋白基因羅非魚影響的初步研究［J］.生物技術，1996，6（005）：9－10.

LI Jing，LI Rong－ping，ZHANG Shu－mei，et al.The influence of low temperature on tilapia of transferred antifreeze protein gene［J］.Biotechnology，1996，6（005）：9－10.（in Chinese）

［9］朱新平，夏仕玲，張躍，等.轉抗凍蛋白基因鯪魚的初步研究［J］.中國水產科學，1997，4（2）：79－80.

ZHU Xin－ping，XIA Shi－ling，ZHANG Yue，et al.Preliminary study on transgenic mudcarp of antifreeze protein gene［J］.Journal of Fishery Sciences of China，1997，4（2）：79－80.（in Chinese）

［10］Cutler A，Saleem M，Kendall E，et al.Winter flounder antifreeze protein improves the cold hardiness of plant tissues［J］.Journal of Plant Physiology，1989，135（3）：351－354.

［11］李天然，張劍峰.抗冷凍蛋白基因轉化甜菜的研究［J］.內蒙古大學學報：自然科學版，1998，29（001）：144－146.

LI Tian－ran，ZHANG Jian－feng，LI Xu－gang.Study on transgenic sugarbeet expressing antifreeze protein（AFP）gene［J］.Acta Scientiarum Naturalium Universitatie Nei Mongol，1998，29（001）：144－146.（in Chinese）

［12］Georges F，Saleem M，Cutler A J.Design and cloning of a synthetic gene for the flounder antifreeze protein and its expression in plant cells［J］.Gene，1990，91（2）：159－165.

［13］Holmberg N，Farres J，Bailey J E，et al.Targeted expression of a synthetic codon optimized gene，encoding the spruce budworm antifreeze protein，leads to accumulation of antifreeze activity in the apoplasts of transgenic tobacco［J］.Gene，2001，275（1）：115－124.

［14］Khanna H K，Daggard G E.Targeted expression of redesigned and codon optimised synthetic gene leads to recrystallisation inhibition and reduced electrolyte leakage in spring wheat at sub－zero temperatures［J］.Plant Cell Reports，2006，25（12）：1336－1346.

［15］Hightower R，Baden C，Penzes E，et al.Expression of antifreeze proteins in transgenic plants［J］.Plant molecular biology，1991，17（5）：1013－1021.

［16］王鋒.植物抗寒基因工程研究進展［J］.福建省農科院學報，1996，11（4）：23－28.

WANG Feng.Advances in the studies of plant cold－resistant genetic engineering［J］.Journal of Fujian Academy of Agricultural Sciences，1996，11（4）：23－28.（in Chinese）

［17］黃永芬，汪清胤，付桂榮，等.美洲擬鰈抗凍蛋白基因 （afp）導入番茄的研究［J］.生物化學雜志，1997，13（4）：418－422.

HUANG Yong－fen，WANG Qing－yin，FU Gui－yong，et al.The research on introducing flounder antifreeze protein gene（afp）into tomato［J］.Chinese Biochemical Journal，1997，13（4）：418－422.（in Chinese）

［18］孫瑞芬.草莓再生及抗凍蛋白基因的遺傳轉化［D］.內蒙古大學，2004.

［19］Panadero J，Randez－Gil F，Prieto J A.Heterologous expression of type i antifreeze peptide gs－5 in baker＇s yeast increases freeze tolerance and provides enhanced gas production in frozen dough［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（26）：9966－9970.

［20］Langellier F.Experiments on frost in 1990 in the champagne vineyard，france ［air stirring，anti－freeze products］［J］.Vigneron Champenois，1991，112.

［21］郭玉華，曾名勇.水產抗凍蛋白的研究進展及在水產行業的應用前景［J］.中國食品添加劑，2007，2：60－65.

GUO Yu－hua，ZENG Ming－yong.Application and research on antfreeze protein for aquatic product［J］.China Food Additives，2007，2：60－65.（in Chinese）

［22］S.R.Payne O A Y.Effects of pre－slaughter administration of antifreeze proteins on frozen meat quallity［J］.Meat Science，1995，41（2）：147－155.

［23］Payne S，Sandford D，Harris A，et al.The effects of antifreeze proteins on chilled and frozen meat［J］.Meat Science，1994，37（3）：429－438.

［24］OSAKA.Scientists extract antifreeze protein from fish［DB／OL］.The free library，2003－03－11 ［2011－12－28］.http：／／www.thefreelibrary.com／Scientists＋extract＋antifreeze＋protein＋from＋fish.－a084336595

［25］Cruz R M S，Vieira M C，Silva C L M.The response of watercress（nasturtium officinale）to vacuum impregnation：Effect of an antifreeze protein type I［J］.Journal of Food Engineering，2009，95（2）：339－345.

［26］V.Kontogiorgos A R，R.Y，Yada，et al.Isolation and characterization of ice structuring proteins from cold－acclimated winter wheat grass extract for recrystallization inhibition in frozen foods［J］.Journal of Food Biochemistry，2007，31（2）：

139－160.

［27］Kontogiorgos V，Goff H D，Kasapis S.Effect of aging and ice structuring proteins on the morphology of frozen hydrated gluten networks［J］.Biomacromolecules，2007，8（4）：1293－1299.

［28］C.Zhang H Z，L.Wang，et al.Improvement of texture properties and flavor of frozen dough by carrot（daucus carota）antifreeze protein supplementation［J］.J Agric Food Chem，2007，55（23）：9620－9626.

［29］Zhang C，Zhang H，Wang L.Effect of carrot（daucus carota）antifreeze proteins on the fermentation capacity of frozen dough［J］.Food Research International，2007，40（6）：763－769.

［30］Zhang C，Zhang H，Wang L，et al.Effect of carrot（daucus carota）antifreeze proteins on texture properties of frozen dough and volatile compounds of crumb［J］.LWT －Food Science and Technology，2008，41（6）：1029－1036.

［31］潘振興，鄒奇波，黃衛寧，等.冰結構蛋白對長期凍藏冷凍面團抗凍發酵特性與超微結構的影響［J］.食品科學，2008，29（008）：39－42.

PAN Zhen－xing，ZOU Qi－bo，HUANG Wei－ning，et al.Effects of ice structuring protein on fermentation characteristics and microstructure of frozen dough during long－term cold storage［J］.Food Science，2008，29（008）：39－42.（in Chinese）

［32］夏露，張超，王立，等.冬小麥抗凍蛋白制備及其在湯圓中的應用研究［J］.食品工業科技，2009，（011）：241－243.

Xia Lu，Zhang Chao，Wang Li，et al.Preparation and application of antifreeze proteins extracted from winter wheat bran［J］.Science and Technology of Food Industry，2009，（011）：241－243.（in Chinese）

［33］Warren G J，Mueller G M，Mc Kown R L.Ice crystal growth suppression polypeptides and method of making［P］.US：5，118，792.1992－06－02.

［34］Daniel A，Fenn R A，Oldroyd J R.Ice confection［P］.US：6，491，960 B1，2002－12－10.

［35］Regand A，Goff H D.Ice recrystallization inhibition in ice cream as affected by ice structuring proteins from winter wheat grass［J］.Journal of Dairy Science，2006，89（1）：49－57.

［36］Regand A，Goff H D.Freezing and ice recrystallization properties of sucrose solutions containing ice structuring proteins from cold－acclimated winter wheat grass extract［J］.Journal of Food Science，2005，70（9）：E552－E556.

［37］Safety of＇Ice Structuring Protein（ISP）＇－Scientific Opinion of the Panel on Dietetic Products.Nutrition and allergies and of the panel on genetically modified organisms［J］.The EFSA Journal，2008，768，1－18.

［38］Crevel R，Fedyk J，Spurgeon M.Antifreeze proteins：Characteristics，occurrence and human exposure［J］.Food and Chemical Toxicology，2002，40（7）：899－903.

［39］Baderschneider B，Crevel R，Earl L，et al.Sequence analysis and resistance to pepsin hydrolysis as part of an assessment of the potential allergenicity of ice structuring protein type iii hplc 12［J］.Food and Chemical Toxicology，2002，40（7）：965－978.

［40］Bindslev－Jensen C，Sten E，Earl L，et al.Assessment of the potential allergenicity of ice structuring protein type iii hplc 12 using the fao／who 2001 decision tree for novel foods［J］.Food and Chemical Toxicology，2003，41（1）：81－87.

［41］Poulsen L K.Allergy assessment of foods or ingredients derived from biotechnology，gene－modified organisms，or novel foods［J］.Molecular Nutrition ＆Food Research，2004，48（6）：413－423.

［42］Hall－Manning T，Spurgeon M，Wolfreys A，et al.Safety evaluation of ice－structuring protein（isp）type iii hplc 12 preparation.Lack of genotoxicity and subchronic toxicity［J］.Food and Chemical Toxicology，2004，42（2）：321－333.

［43］Crevel R W R，Cooper K J，Poulsen L K，et al.Lack of immunogenicity of ice structuring protein type iiihplc12 preparation administered by the oral route to human volunteers［J］.Food and Chemical Toxicology，2007，45（1）：79－87.

［44］Cummins J，Ho M W.Gm protein for ice cream not ready for commercial use［R／OL］.Institute of Science in Society Report，2007－04－16［2011－12－28］.http：／／www.i－sis.org.uk／GMProtein For Ice Cream.php＊ ［45］A／F Protein，72 Bonad Road，West Newton，MA（1993）.http：／／www.afprotein.com／

［46］Peltier R，Evans C W，DeVries A L，et al.Growth habit modification of ice crystals using antifreeze glycoprotein（afgp）analogues［J］.Crystal Growth ＆ Design，2010，10（12）：5066－5077.

［47］Peltier R，Brimble M A，Wojnar J M，et al.Synthesis and antifreeze activity of fish antifreeze glycoproteins and their analogues［J］.Chemical Science，2010，1（5）：538－551.

［48］Gibson M I.Slowing the growth of ice with synthetic macromolecules：Beyond antifreeze（glyco）proteins［J］.Polymer Chemistry，2010，1（8）：1141－1152.

Research Progress of Antifreeze Proteins Application in Food and Its Safty Analysis

ZHANG Hui，DING Xiang－li

（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Antifreeze proteins（AFPs）is the general name of proteins which have the ability to enhance antifreeze capacity of organisms.They can lower the freezing point，modify morphology and inhibited the recrystallization of the ice，et al.In this article，applications of AFPs in food material production，processing and storage were outlined and its safty were analysised briefly in order to provide reference to future application of AFPs in food industry.

antifreeze proteins（AFPs），food，application，gene modification，safty

Q 51

A

1673－1689（2012）05－0455－07

2011－03－22

國家自然科學基金項目（31171637）；中央高校基本科研業務費專項資金項目（JUDCF10060）。

張暉（1966－），女，上海人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事谷物功能性成分和健康食品的研究。E－mail：zhanghui＠jiangnan.edu.cn