鼻咽癌組織中上皮-間葉轉換的檢測及與其轉移的相關性

羅愛華 高 嵋 謝 樂 黃卓雅 李飛虹 蔡瓊珍 姜漢國

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)在全世界內流行，特別是中國南方如廣東、廣西、香港多見，與EB病毒感染密切相關[1,2]，大約60%的患者是在頸部淋巴結發生轉移后，因頸部腫物而就診，經臨床穿刺或活檢證實后已屬晚期。放療和化療的聯合應用是NPC的常規治療方法，雖然部分患者對放療敏感，但仍約有40%～60%的鼻咽癌患者因遠處轉移、局部復發及放化療副作用等原因導致死亡，其中最為重要的是NPC的遠處轉移。因此，研究其轉移的機制一直是鼻咽癌基礎和臨床上一個非常重要的課題之一。

雖然目前惡性腫瘤的浸潤和轉移機制仍不完全清楚，但得到共識的是惡性腫瘤的浸潤和轉移包括多個步驟和環節[3]。近年來，一些研究提示腫瘤的上皮-間葉轉換(EMT)與一些腫瘤的轉移密切相關[4～7]。為觀察是否鼻咽癌具有EMT樣作用及其與轉移的關系，我們應用免疫組化法，檢測130例鼻咽未分化型非角化性癌中Vimentin和E-cadherin(E-cd)的表達，旨在探討它們與鼻咽癌轉移的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 收集廣東醫學院附屬醫院和附屬高州人民醫院2004年～2007年收治的鼻咽癌患者130例，其中男性76例，女性54例，中位年齡47歲，檢測前未經過任何放療和化療，按WHO分類均為未分化型非角化性癌，其中53例經活檢、細胞學穿刺和免疫組化檢查證實頸部淋巴結已發生轉移，內有23例為配對淋巴結鼻咽癌轉移，其余77例病理檢查確診鼻咽癌時影像學檢查未發現局部浸潤、轉移性病變和腫大的淋巴結。

1.1.2 試劑及抗體 鼠抗人Vimentin和E-cadherin單克隆抗體及免疫組織化學試劑盒均購于北京中衫金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 常規HE染色，鼻咽癌分別按WHO分型及有無淋巴結轉移進行分組。

1.2.2 免疫組織化學染色 免疫組化按SP試劑盒說明書進行操作。由試劑公司提供的陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為空白對照。

1.3 結果判斷

Vimentin 陽性表達均定位于細胞質，E-cadherin陽性表達定位于細胞膜，陽性表達均呈棕黃色或棕褐色顆粒樣分布。由兩人分別獨立對實驗結果進行雙盲法評估。每一切片隨機選擇5個視野(×100)，在顯微鏡(×400)下計數每個視野100個腫瘤細胞中陽性細胞比例，非癌組織則計數著色區100個細胞中陽性細胞比例，取5個視野的平均百分數為判定結果。光學顯微鏡下觀察，根據棕黃色陽性信號的強弱和面積判斷結果：陽性細胞數<10%為陰性表達；10%～50%為陽性表達；>50%為強陽性表達。結果判斷，①按陽性細胞百分率計分：陽性細胞數≤10%為0分；11%～50%為1分；>50%為2分。②按染色強弱計分：淡黃色為0分；黃色為1分；棕黃色為2分。兩項分數相加得0～1分為陰性；2～3分為陽性；4分為強陽性；0分和1分為-；2分為+；3分為++；4分為+++。

1.4 統計學分析

實驗數據資料統計采用統計學軟件SPSS for Window 11.0(SPSS Inc.,U.S.A)做四格表的卡方檢驗，Spearman相關分析。

2 結果

2.1 E-cadherin和Vimentin在鼻咽癌轉移組和非轉移組中的表達情況

鼻咽癌轉移組與非轉移組中E-cadherin和Vimentin陽性表達率分別為62.3%(33/53)、60.4%(32/53)和84.4%(65/77)、27.3%(21/77)。轉移組與非轉移組E-cadherin 和Vimentin表達比較有顯著性差異(P<0.01)；鼻咽癌轉移組與非轉移組相比，Vimentin陽性表達水平明顯上調，而E-cadherin陽性表達水平則明顯下調，見表1。

2.2 E-cadherin和Vimentin在鼻咽癌原發灶及其配對淋巴結轉移灶中的表達情況

鼻咽癌原發灶及其配對淋巴結轉移灶中E-cadherin和Vimentin陽性表達率分別為78.3%(18/23)、65.2%(15/23)和47.8%(11/23)、30.4%(18/23)。E-cadherin和Vimentin陽性表達率鼻咽癌原發灶與其配對淋巴結轉移灶比較有顯著性差異(P<0.05)，鼻咽癌原發灶與其配對淋巴結轉移灶相比，E-cadherin陽性表達水平明顯下降，其中表達缺失相對少見，大部分為異常表達即由胞膜定位轉變為胞質內表達，鼻咽癌原發灶內Vimentin陽性表達較多見，主要見于梭形癌細胞和少數上皮樣癌細胞，而淋巴結轉移灶中Vimentin陽性表達水平下調，多見于梭形癌細胞和少數上皮樣癌細胞，而泡狀核癌細胞一般呈陰性表達，見表1。

表1 E-cadherin和Vimentin在鼻咽癌、原發灶及其配對淋巴結轉移灶中的表達情況(例，%)

注：▲為與轉移組比較，P<0.01；*為與原發灶比較，P<0.05

2.3 鼻咽癌中Vimentin與E-cadherin表達的相關性

鼻咽癌轉移組中，Vimentin與E-cadherin表達呈負相關性，Spearman相關分析結果為:γ=-0.448，P=0.001，見表2。

表2 鼻咽癌轉移組中Vimentin和E-cadherin表達的相關性

鼻咽癌非轉移組中，Vimentin與E-cadherin表達呈負相關性，Spearman相關分析結果為：γ=-0.356，P=0.001，見表3。

表3 非轉移組中Vimentin與E-cadherin表達的相關性

2.4 鼻咽癌原發灶及其配對淋巴結轉移灶中Vimentin與E-cadherin表達的相關性分析

在鼻咽癌原發灶中，Vimentin與E-cadherin表達無相關性，Spearman相關分析結果為：γ=-0.010，P=0.963，見表4。在鼻咽癌配對淋巴結轉移組中，Vimentin與E-cadherin表達無相關性，Spearman相關分析結果為：γ=0.228，P=0.296，見表5。

表4 鼻咽癌原發灶中Vimentin與E-cadherin表達的相關性

表5 鼻咽癌配對淋巴結轉移灶中Vimentin和E-cadherin表達的相關性

3 討論

EMT是近年研究腫瘤轉移的一個熱點，而EMT與黏附分子功能的改變密切相關[5,8]。 EMT是指上皮細胞向間葉細胞細胞表型轉換，在此過程中上皮細胞失去極性，細胞-細胞及細胞-間質之間的黏附性發生改變，細胞內的肌動蛋白重排，最終細胞獲得更強的遷移、侵襲和轉移能力。現在多數學者認為，EMT是上皮源性腫瘤轉移最為關鍵的步驟和非常重要的條件[9～11]。在EMT過程中，上皮性腫瘤細胞最主要的表型變化是向間葉轉換，其中最常應用和公認的指標是檢測其E-cadherin和Vimentin表達的情況[12～14]。

E-cadherin是1種分子量為120 kD的跨膜單鏈多肽糖蛋白，其胞質內羧基端與α-、β-、和γ-連還素(catenins)形成E-cad/cat復合體，然后此復合體與細胞內肌動蛋白微絲系統發生結構上的聯系，通過介導細胞間的黏附和信號轉導，參與調節組織發生與形態分化，對細胞的識別、遷移等行為發揮非常重要的作用。任何因素改變E-cad/cat復合體中各個成分的表達、結構或破壞復合體與細胞骨架連接，都會導致E-cad/cat復合體功能的下降或喪失，導致細胞間黏附性下降，最后引起細胞的分離和移動。目前很多研究揭示，E-cad表達下調或缺失是導致惡性腫瘤轉移的關鍵因素之一[15]。除了E-cad表達下調可影響E-cad/cat復合體的功能，E-cad表達部位也與其功能密切相關：因E-cad是Ca2+依賴性的，當Ca2+濃度下降時，不僅使Ca2+胞外5個重復系列的構型發生改變，蛋白酶作用位點曝露，以致膜上E-cad被降解，而且可使細胞內骨架成分如肌動蛋白等成分在細胞內重新分布，從細胞膜進入到細胞質中，E-cad的不能定位于細胞膜而喪失其介導細胞黏附的功能，使細胞之間變的松散。

除了具有重要黏附分子的功能以外，最近研究還發現E-cad/cat與腫瘤的上皮-間葉轉換(epithelial-mesenchymal transtition,EMT)密切相關[5,8]。在我們130例鼻咽未分化型非角化性癌的病例中，其中淋巴結轉移組中Vimentin陽性表達率明顯高于非轉移組，兩組比較在統計學上有顯著性差異，這說明鼻咽癌表型的改變即具有某些間葉特征的腫瘤細胞更易發生轉移。未分化型非角化性癌占所有的鼻咽癌90%以上，其中形態呈梭形的又占有相當的比例，部分病例顯示上皮樣與梭形混合存在，是一個非常典型的具有異質性的惡性腫瘤。我們研究發現呈梭形的鼻咽癌細胞Vimentin的陽性表達較強，往往呈片塊狀陽性，而上皮樣的癌細胞Vimentin陽性表達較弱，往往顯示點灶狀陽性，有時在部分區域的可以看到2種形態癌細胞并存，其Vimentin陽性表達會顯示明顯的差異性，表現為梭形的癌細胞陽性表達往往強于其臨近的上皮或泡狀核癌細胞，以上的形態學和免疫組織化學結果，支持了部分上皮源性惡性腫瘤向間葉轉化的假說，同時也揭示EMT樣改變與鼻咽癌的轉移密切相關，這與一些學者在其它上皮上皮源性惡性腫瘤觀察的結果是相吻合的[16～18]。為了進一步證實鼻咽癌細胞轉移與細胞黏附分子缺失和間葉轉換間的關系，我們對23例鼻咽癌原發灶和其配對淋巴結轉移灶同時進行E-cadherin和Vimentin免疫組織化學染色，免疫組化結果顯示淋巴結轉移灶中E-cadherin陽性表達水平明顯低于其相對應的鼻咽癌原發灶，表達完全缺失相對少見，大部分陽性為異常表達即胞質內表達，這說明在轉移過程中，E-cad的構型發生了改變，蛋白酶作用位點曝露，以致膜上E-cad被降解，而且可能使細胞內骨架成分如肌動蛋白等成分在細胞內重新分布，從細胞膜進入到細胞質中，E-cad的不能定位于細胞膜而導致cad/cat復合體功能的障礙影響了細胞黏附功能，使細胞之間變松散。同時，我們也觀察到鼻咽癌原發灶中Vimentin陽性表達水平明顯高于其配對淋巴結轉移灶，并具有顯著性差異，說明在轉移最初階段Vimentin發揮重要作用，同樣，Vimentin陽性也預示其轉移的可能性增加，這與有些學者觀察的結果相吻合[16]。引起這種Vimentin改變機制有許多假說和理論，但目前仍然不完全清楚，不同的學者通過研究不同的樣本得出不同的結論[19～22]。有學者研究顯示鼻咽癌的EMT與EB病毒感染密切相關[23]。

通過Spearman相關分析我們發現，在未分化型非角化性癌淋巴結非轉移組中，Vimentin蛋白表達與E-cadherin蛋白表達呈負相關，表現為Vimentin蛋白表達水平明顯上調，而E-cadherin蛋白表達水平顯著下調。而在轉移組中，Vimentin蛋白表達與E-cadherin蛋白表達呈負相關，表現為Vimentin蛋白表達上調，E-cadherin蛋白表達下調，這說明Vimentin與E-cadherin表達密切相關，而23例未分化型非角化性癌原發灶與其配對淋巴結轉移灶中，Vimentin蛋白表達與E-cadherin蛋白表達Spearman相關分析結果揭示了同樣的趨勢，但在統計學方面無相關性，這可能與我們收集的樣本數量過少有關。

總之，我們的研究提示，鼻咽未分化型非角化性癌具有EMT樣作用，同時其EMT與腫瘤的轉移密切相關，這為以后研究腫瘤轉移發生的機制及其防治提供新的思路。

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