DNA-PKcs的研究進展

蔡 昱綜述 翟建軍審校

DNA-蛋白激酶 (catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase，DNA-PKcs)是DNA依賴蛋白酶 (DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)的催化亞單位，屬于PI3K家族，主要從事雙鏈DNA斷裂修復，在細胞的凋亡和防止腫瘤形成及腫瘤的耐藥、耐輻射中起著作用。我們對DNA-PKcs的結構功能、作用機制及在腫瘤中的作用作一探討。現將其綜述如下。

1 DNA-PKcs的結構及功能

DNA-PKcs也稱為DNA活化蛋白酶，是1個460～470 kD絲氨酸蘇氨酸酶，屬于1種腫瘤抑癌基因的看家基因[1]。DNA-PKcs作為1個具有催化活性的次單元體與1個具有結合DNA能力而調控其激活性的次單元體Ku共同組成DNA-PK[2]。DNA-PKcs同共濟失調毛細血管擴張突變基因(ataxia telangiectasia,mutated,ATM)和Rad3相關蛋白 (ATM-andRad3-related,ATR) 激酶均屬于PI3K家族[3]。最近幾年的研究，發現DNA-PKcs主要從事雙股DNA斷裂(DNA Double -Strand Break;DSBs)的非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)的修復和產生抗體多樣性V(D)J重組及復制調節。除此之外，DNA-PKcs在基因的轉錄調控、核染色質及端粒結構的維持、T淋巴細胞及B淋巴細胞的發育中也具有相當重要的作用。如果沒有基因重排,B細胞就不能成熟，因為B細胞所攜帶的抗體是由V(D)J區的特定組合和連接過程中所附加的核酸所決定的[4～9]。

2 DNA-Pkcs作用機制

2.1 在NHEJ和V(D)J 重組中的作用

生物體本身基因的完整性容易受一些外在環境因素影響，輻射線的傷害或是一些化學試劑的破壞都會造成DNA的雙股鏈斷裂(double-strand break，DSBs)，DSBs也會在免疫球蛋白的位置特一性V(D)J 重組過程中產生。DNA的DSBs無法修補或是不正確的修補都將使染色體產生變異，從而導致細胞的癌變或是死亡。因此，對真核細胞來說DSBs的修補與維持保有基因的完整性是非常重要的，其中最主要的修補機制就是NHEJ。這種修復機制的特性是2個重組DNA分子并不需要互補的DNA序列。NHEJ的修補成員有DNA-PKcs、Ku、DNA連接酶(DNA-ligase)Ⅳ和XRCC4 蛋白等，其中以DNA-PKcs為主要作用。NHEJ在免疫細胞的分化和發育上，在抗體多樣性的V(D)J 重組作用方面亦扮演尤為重要的角色。NHEJ經由V(D)J 重組可產生多樣性的抗體和T細胞接受子以認識及對抗外來的抗原[9～11]。

所謂的V(D)J 重組是由任一V (Variable)基因片段和任一的D (Diversity) 或J (Joining)基因的片段隨意連接在一起以解釋成可認識抗原的功能區。簡單來說，V(D)J 重組作用可分成2個階段，第一、2個淋巴細胞特有的蛋白質，RAG1 和RAG2 (重組活化基因)認識RSS (重組信號序列)于V ，D 和J 基因兩側，進行雙股DNA斷裂(DSB)，產生開始信號端(Signal ends)和發夾狀帶碼端(Hairpined coding ends)。第二、經由NHEJ 的作用，開始信號端和發夾狀帶碼端分別連接在一起。目前已知參與連接的蛋白質和NHEJ 的DNA DSB 修復為相同的蛋白質，有4個重要的互補分布群組在NHEJ 中扮演重要的角色，分別是XRCC4,XRCC5,XRCC6 及 XRCC7 。XRCC4與DNA 連接酶Ⅳ共存在同一多蛋白質復合體中，XRCC4 可以增加DNA連接酶Ⅳ的活性。而XRCC5,XRCC6 及XRCC7 則分別代表Ku80,Ku70及DNA-PKcs的基因。因此，DNA-PK在NHEJ中也扮演著尤為重要的角色[12，13]。

2.2 調控機制

2.2.1 Ku對DNA-PKcs的調控作用 Ku蛋白是DNA結合蛋白，是Ku70/Ku80異源二聚體，這個復合體能補充、活化DNA依賴激酶催化亞單位(DNA-PKcs)共同組成DNA依賴激酶(DNA-PK) 。Ku是1個功能保守的端粒蛋白，它從啤酒酵母到人都十分保守，緊密結合于雙鏈DNA的突出端或平末端。Ku同DNA-PKcs一起，參與由非同源末端融合導致的DNA鏈斷裂和V(D)J重組中DNA鏈的修復，也可能通過進化保守機制同時參與端粒的復制和染色體的末端保護。一般認為DNA-PK的活化模式是透過Ku 的作用。Ku 可以結合到受損雙股DNA 的斷裂處，似乎Ku可以辨認DNA的DSBs，結合在DNA的Ku 經由其立體結構的變異，促使DNA-PKcs 在DNA/Ku 的復合體上組合，以形成1個具有反應活性的多蛋白質復合體 DNA/Ku/DNA-PKcs 。此反應復合體可以促使 NHEJ 成員的組合或是會影響到一些參與NHEJ 因子的活性。此種方式，一方面可以防止受損DNA 的末端繼續受到其他核酸酶的作用，另一方面Ku/ DNA-PKcs 可以增加DNA 連接酶的活性，促使受損DNA 的末端相互連接。這證明Ku蛋白和DNA-PKcs在維持人體正常免疫功能，調節DNA修復，防止細胞惡變方面有很重要的作用[9，14]。

2.2.2 其他因素對DNA -PKcs磷酸化的調控 DNA-PK 在DSB 的修補與V(D)J 的重組中是扮演著重要的角色，而DNA-PK的活性也會受到DNA-PKcs磷酸化的調控。DNA-PKcs 的自我磷酸化會使其與Ku 分開而抑制 DNA-PK 的催化活性；另外就是依賴白血病病毒(c-Abl)對DNA-PK 的調控模式，活化的c-Abl 會使DNA-PKcs 磷酸化，促使DNA-PKcs/Ku 復合體的分開而抑制 DNA-PK 的催化活性。此外，在細胞的凋亡過程中，DNA-PKcs 會被Caspase-3 所分解而喪失激酶活性；PKC δ 也會抑制DNA-PK 的激酶活性[15，16]。

2.3 DNA-Pkcs與端粒的關系

端粒，線性染色體的自然末端，包含非編碼的富鳥苷酸的重復序列，并終止于1個富鳥苷酸單鏈突出端。它的2個特征—序列和結構—提供了1個末端處蛋白作用的平臺，從而形成了1個保護性的“帽”，使得端粒免于象別的DNA雙鏈一樣斷裂，如降解或非同源重組；且在維持遺傳的穩定性和阻止癌變中也起著重要的作用。已有研究發現DNA-PKcs在端粒的帽子形成、維持端粒長度及穩定性中起著作用。端粒酶缺陷的人體細胞中DNA-PKcs的丟失可加速端粒的降解及細胞凋亡，或染色體不穩定性增加，最終導致癌癥。可見DNA-PKcs在癌癥和老化中起著關鍵作用[9，10]。

3 DNA-PKcs在腫瘤中的作用

機體受內外環境因素的影響，發生不同類型的DNA損傷,但是機體具有多種修復系統修復損傷,恢復DNA結構和功能。如果DNA-PKcs(機體最主要的修復系統組成部分DNA-PK的核心成員)丟失DNA修復缺陷,表現出基因組不穩定性，就會導致一些細胞生長調控基因等的失活,從而促使細胞的惡性轉化[5]。

從癌變細胞的細胞核型分析結果可以看出,癌變細胞普遍存在染色體缺失現象,惡性轉化細胞的DNA斷裂修復能力明顯降低。通過基因芯片,分子雜交等分析,發現惡性轉化細胞或轉化早期階段部分DNA修復基因的表達發生明顯改變,如XRCC-2,XRCC-3和Ku80(XRCC-5)的mRNA表達下調,但發現其中屬于PI3K激酶家族成員的修復基因DNA-PKcs在細胞的惡性轉化早期階段受到抑制,惡性轉化后表達又上升[1，17，18]。

目前有人用免疫組化法檢測肝膽腫瘤組織和部分癌旁組織中催化亞基DNA-PKcs蛋白的表達情況。結果發現DNA-PKcs表達在不同類型腫瘤間存在明顯差異。肝細胞癌、膽管腺癌和膽囊腺癌的DNA-PKcs陽性表達率依次降低，而乳頭狀腺瘤或膽管腺瘤則不表達或弱表達。侵襲性腺瘤(癌)組織表達水平顯著高于非侵襲性腺瘤(癌)。癌旁組織相對低表達DNA-PKcs。表明DNA-PKcs表達水平與腫瘤類型、惡性程度、轉移或侵襲性有關，有可能成為肝膽腫瘤的1個新的生物標志物[19]。但是有研究發現結腸上皮中DNA-PKcs看家基因受一些因素破壞，容易發生結腸癌[20]；還發現SCID小鼠易患T細胞淋巴瘤[2]，且胸腺細胞受電離輻射激活p53誘導細胞凋亡，但并不能阻斷細胞周期[21]；因此對于DNA-PKcs是致癌還是抑癌作用尚待進一步研究。

許多動物及細胞的模式實驗，已顯示出SCID(Severe combined immunodeficiency)小鼠有DNA-PKcs 基因的突變，造成其對輻射線的高度敏感性與V(D) J 重組的嚴重缺陷[4，22]。SCID小鼠非小細胞肺癌(NSCLC)中DNA-PKcs的高表達致使DNA損傷修復系統活性增高，這是NSCLC放療抗拒性的重要原因[23]，可能由于正常情況下DNA-PK基因修復受損的基因，癌細胞也利用DNA-PK基因來修復由抗癌治療引起的損傷，使得腫瘤對治療產生抵抗。

總之，DNA-PKcs作為人體修復系統的重要組成部分DNA-PK的核心成員，主要從事DSBs的修復，在端粒及染色體結構的維持、細胞的凋亡、抑制腫瘤方面有著重要的作用。

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