Livin與Survivin在鼻咽癌組織中的表達及臨床意義

陳吉添 陳 瑜 吳薇紫 陳 虹

鼻咽癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，特別在廣西高發，主要死亡原因為局部未控或遠處轉移。Livin是凋亡抑制細胞蛋白(inhibitor of apoptosis family of proteins，IAPs)家族的新成員，在大多數惡性腫瘤中高表達，起到抑制細胞凋亡的作用[1]。Survivn基因同屬于IAP家族的成員，具有抗凋亡、調節細胞周期和參與血管生成的作用。Survivin在正常組織中是1個“關閉”的基因，在腫瘤組織中被激活而參與腫瘤的發生發展[2]，因此被看做是腫瘤相關基因。本研究采用免疫組織化學方法對鼻咽癌組織檢測鼻咽癌與鼻咽慢性炎組織中Livin和Survivin蛋白表達的情況，以了解它們在鼻咽癌中的表達情況及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料來源

80例鼻咽癌組織標本，均來自廣西靈山縣人民醫院2003年1月～2004年12月收治的患者。所有患者為初治病例，確診為鼻咽低分化鱗癌，未行放療和化療處理。80例中男性61例，女性19例，年齡26～72歲，中位年齡48歲。采用1992年福州會議標準分期。另取30例鼻咽慢性炎組織作為對照組。放療后隨訪截止至2010年1月。

1.2 方法

免疫組織化學檢查采用Envision兩步法。Livin鼠抗人單克隆抗體購自美國Neomarkers公司，抗體稀釋濃度為1∶150。Survivin鼠抗人單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，抗體稀釋濃度為1∶100，即用型快捷MaxvisionTM檢測試劑盒購自福州邁新生物技術科技公司。整個過程按試劑盒說明書進行。每批染色均設已知陽性切片作陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(phosphatic buffered saline，PBS)代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判斷

Livin表達產物主要定位于細胞質，少部分細胞核也有不同程度的染色，呈棕黃色顆粒為陽性細胞。Survivin的陽性表達以細胞質出現棕褐色顆粒為準。由2位醫師采用雙盲法觀察每張切片。判斷陽性判斷參照許良中等的報道[3]：首先按切片中癌細胞染色強度計分：0分細胞無顯色；1分呈淡黃色；2分呈棕黃色；3分呈棕褐色(染色深淺需與背景著色相對比)；再按切片中陽性癌細胞數所占的百分比打分：0分為陰性，1分為陽性癌細胞≤10%；2分為11%～50%，3分為50%～75%，4分為75%以上。染色強度與陽性細胞百分比的乘積>3分才算免疫反應陽性。

1.4 統計學處理

統計學處理采用SPSS11.0軟件進行χ2檢驗，Spearman相關性分析，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌組織及鼻咽慢性炎組織中Livin和Survivin蛋白的表達

鼻咽癌組織及鼻咽慢性炎組織中Livin表達陽性率分別為61.25%(49/80)和16.67%(5/30)，兩組間差異有統計學意義(χ2=17.352,P<0.05)；Survivin表達陽性率分別為68.75(55/80)和20.00%(6/30)，兩組間差異有統計學意義(χ2=20.991,P<0.05)。

2.2 Livin和Survivin蛋白表達與鼻咽癌臨床病理特征的關系

通過比較Livin和Survivin表達與臨床病理特征之間的關系發現，Livin蛋白表達陽性在頸部淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤復發、臨床分期組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，在性別、年齡及T分期等組間差異無統計學意義(P>0.05)；Survivin蛋白表達在T分期、頸部淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤復發及臨床分期組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，在性別、年齡等組間差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 Livin和Survivin蛋白表達與鼻咽癌臨床病理特征的關系

2.3 Livin和Survivin蛋白在鼻咽癌組織中表達的相關性

鼻咽癌組織中Livin的陽性表達率61.25%(49/80)，Survivin的陽性表達率為68.75%(55/80)，兩者均為陽性者38例，經Spearman相關性分析，Livin和Survivin蛋白表達在鼻咽癌組織中表達呈顯著正相關(γ=0.239，P=0.033)(表2)。

表2 鼻咽癌組織中Livin和Survivin蛋白表達的關系(例)

3 討論

腫瘤的發生、發展與細胞凋亡的紊亂密切相關。凋亡受抑制將導致細胞存活時間延長，有利于轉化突變的細胞生長積累，最終導致腫瘤的產生。細胞凋亡通路和p53、C-myc、Bcl-2家族、Smac、抑制凋亡蛋白家族(IAPS)及細胞內信號轉導等通路構成1個復雜的網絡對凋亡進行精細地調控。Livin是新近發現的1個IAPS家族成員，Ashhab等[4]通過RT-PCR證明Livin轉錄產物因剪接方式不同有2種mRNA亞型即Livinα和Livinβ。Livin抑制細胞凋亡作用主要通過其BIR區與Caspase結合，抑制Caspase酶的活性，尤其是抑制Caspase-3/-7和Caspase-9的活性，達到阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎的凋亡途徑而起作用。Livin在胚胎組織中存在，可能與生長發育有關，在正常成人的大多數終末組織中低表達或不表達[1]。研究顯示在很多人類惡性腫瘤中Livin高表達，H-B Liu等[5]研究顯示，在膀胱癌中，Livinα的表達率為39.58%(19/48)，在15例無腫瘤的組織中未見表達，其表達與腫瘤的復發密切相關。Ihab Adb-Elrahman等[6]亦通過動物模型的研究推斷Livin在腫瘤發生學中有著重要作用，Livin可作為腫瘤治療的重要靶點。我們的研究結果與之類似，在鼻咽癌組織中其表達(61.25%，49/80)顯著高于鼻咽慢性炎組織(16.67%，5/30)，同時Livin的表達與頸部淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤復發、臨床分期呈顯著的正相關，提示Livin蛋白可能參與了鼻咽癌的惡性演進過程，可作為反映鼻咽癌惡性程度的參考指標之一。

Survivin同樣是IAP家族成員，是目前研究的熱點。它可以調控細胞凋亡，通過直接阻滯Caspase-3和Caspase-7的作用而抗凋亡[7]，從而有利于細胞的異常增殖和惡性轉化。另外它還具有調節細胞有絲分裂的功能，可對抗G2/M期凋亡的誘導，從而克服細胞凋亡的檢查點，允許變異細胞通過有絲分裂異常增殖。Survivin在多數人類腫瘤中均有過表達[2]，我們的實驗結果亦顯示在鼻咽癌中它的表達顯著高于鼻咽炎組織，提示在鼻咽癌發生的早期過程中可能Survivin已經被激活，并起了一定作用。目前有愈來愈多文獻報道Survivin在癌組織中的表達與惡性腫瘤的侵襲和預后有關。我們的研究結果亦得到了類似結論，Survivin蛋白表達在T分期、頸部淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤復發及臨床分期呈顯著正相關，提示了其與鼻咽癌惡性進展的密切關系。

從理論上分析，Livin與Survivn在抑制凋亡的機理上部分相似，如都會通過抑制Caspase酶的活性，尤其是抑制Caspase-3/-7和Caspase-9的活性，達到阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎的凋亡途徑而起作用，但兩者的組織構型并不一致，作用的結果也不一樣，如Livin的作用僅局限于調節細胞凋亡，而Survivin在腫瘤中既調節凋亡也調節細胞分化等。國內兩者相關的報道，劉益飛等[8]在非小細胞肺癌中，Livin與Survivn兩者無相關性；而趙麗華等[9]在胃癌中的研究顯示兩者呈顯著正相關。我們的研究顯示兩者在鼻咽癌中為顯著正相關，但兩者僅是弱的正相關，說明兩者在鼻咽癌的發生和進展中可能存在的相互協調促進的作用，存在著一定的聯系。但作用機制上存在著差異，可能與基因的誘導因素、調節因素以及傳導通路，以及不同腫瘤的發生進展機理上都存在差異，有待更基礎和更具體的研究。

鼻咽癌的發生發展與腫瘤細胞凋亡機制受損密切相關，高表達的IAP蛋白使癌細胞凋亡耐受，這也是臨床上化療耐藥、放療不敏感等現象的重要原因之一?？傊?，Livin與Survivin的高表達在鼻咽癌的發生及發展中起了重要的作用，可能兩者是鼻咽癌細胞凋亡信號傳導網絡中重要的一環，聯合檢測兩者在鼻咽癌中的表達情況，有助于評價鼻咽癌的預后情況，并為鼻咽癌的基因靶向治療提供了新的途徑。

[1] Kasof GM，Comes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member〔J〕.J Biol Chem,2001,276(5):3238.

[2] Zaffaroni N，Pennati M，Daidonge M G.Survivin as a target for new anticancer interventions〔J〕.J Cell Mol Med,2005,9(2):360.

[3] 許良中，楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準〔J〕.中國癌癥雜志，1996,6(4):229.

[4] Ashhab Y，Alian A，Polliack A，et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern〔J〕.FEBS Lett,2001,495(4):56.

[5] H-B Liu，Chui-Ze Kong,Yu Zeng，et al.Livin may serve as marker for prognosis of bladder cancer relapse and a target of bladder cancer treatment〔J〕.UROLOGIC ONCOLOGY，2009,27(3):277.

[6] Ihab Adb-Elrahman，Klilah Hershko，Tzahi Neuman，et al.The inhibitor of apoptosis protein Livin (ML-IAP) plays a dual role in tumorigencity〔J〕.Cancer Res,2009,69(13):5475.

[7] Deveraux QL，Reed J C.IAP family proteins-suppressors of apoptosis〔J〕.Genes Dev,1999,13(3):239.

[8] 劉益飛，施公勝，劉俊華，等.凋亡抑制蛋白livin在人非小細胞肺癌中的表達以及和survivin表達的關系〔J〕.現代腫瘤醫學，2010,18(2)：294.

[9] 趙麗華，趙文江，郝建軍，等.Livin和Survivin在胃癌組織中表達及其臨床意義〔J〕.現代中西醫結合雜志，2009,18(8)：841.