塞來昔布對人肝癌細胞增殖抑制及放療增敏作用

王中煥 楚建軍 張福正 沈 玲 楊 雪

原發性肝癌是我國高發的惡性腫瘤之一，大多數肝癌患者在發現時已經喪失了手術機會，而介入治療對肝癌伴門脈癌栓患者效果不佳。放療是輔助治療肝癌的有效手段之一，近期， COX-2抑制劑塞來昔布在實體瘤腫瘤輔助治療中的作用引起研究人員的關注。本實驗旨在探討COX-2抑制劑塞來昔布聯合放療，對人肝癌細胞株huh-7凋亡及細胞周期的影響，以及塞來昔布對huh-7放療敏感性的影響，為提高肝癌的放療效果提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人肝癌huh-7細胞株由國家人類基因組南方研究中心韓澤廣教授惠贈。塞來昔布為輝瑞公司產品。DMEM高糖培養液、胰蛋白酶(TryPsin)購自南京凱基生物科技發展有限公司；放射治療設備為美國Varian公司的23EX電子直線加速器；FACS Vantage SE型流式細胞儀為美國BD公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人肝癌細胞株huh-7細胞培養液為高糖DMEM，含10%胎牛血清、青鏈霉素各100 μl/ml，NaHCO3調節pH至7.2，培養于37℃、5%CO2濃度，飽和濕度培養箱中。Huh-7細胞為貼壁細胞，一般48 h換液1次，待細胞長滿瓶底約80%時，用0.25%胰酶消化傳代，一般按照1∶3的比例，每48～72 h傳代1次。將塞來昔布溶于(dimethylsulfoxide，DMSO)其中配置出濃度為100 μmol/L的母液，放入-20℃冰箱。然后用培養基稀釋到所需要的濃度，DMSO終濃度不超過0.1%。

1.2.2 MTT法測定塞來昔布對huh-7 細胞增殖的影響 用胰蛋白酶消化對數生長期的huh-7細胞，制備成單細胞懸液。以每孔 5×103個細胞接種于 96 孔培養板，24 h 后換液,加入不同濃度塞來昔布使其終濃度分別為6.25、12.5、25、50、75、100 μmol/ L。以未進行藥物干預的細胞為對照組。每種濃度平行3個復孔，分別于加藥后24、48、72 h無菌條件下吸去上清，加入無血清的培養液100 μl/孔，并加入MTT 50 μl/孔，繼續培養4 h，吸去每孔的液體，加入DMSO 150 μl/孔，振蕩器上振蕩溶解 5～10 min，以空白對照調零，應用自動酶標儀，在490 nm波長處測出各實驗組的吸光度 A 值。以上實驗重復3次。存活率=(藥物實驗組A平均值/細胞對照組A平均值) ×100%； 抑制率(%)=1-存活率。

1.2.3 細胞的照射與分組 取對數生長期的單細胞懸液，于接種24 h后鏡下觀察細胞貼壁，然后進行不同處理，分為4組：①對照組：未接受藥物和照射處理；②藥物組：加入塞來昔布，使其終濃度為25 μmol/L；③單純照射組;④聯合組：加藥2 h后進行照射。細胞照射：醫用直線加速器的6 MV-X射線照射，機架角180°,射野25 cm×24 cm，劑量率200 cGy/min，吸收劑量4 Gy。照射時將培養瓶的細胞面朝下，周邊以封口膜封口，以保證細胞不被污染，培養瓶上做好分組標記，瓶上下墊一塊1.5 cm厚的等效有機玻璃板，放療源到有機玻璃板面的距離為100 cm，4 Gy等中心照射后,繼續培養受照細胞。

1.2.4 細胞周期和細胞凋亡率的檢測 處理48 h后收集細胞。收集過程：用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)將細胞消化成單細胞懸液，2 000 r/min離心5 min，棄上清，冷PBS洗滌2次后用500 μL PBS重懸，收集細胞數目約(1～5)×105個，加入預冷的70%冰乙醇1 ml，邊加邊用手輕微震蕩混勻，-20℃固定過夜。檢測時用冷PBS洗滌2次后，分別加入細胞周期試劑盒中的RNA酶和PI，按照說明書的步驟操作后，將樣品經300目濾網過濾，應用流式細胞儀專用的試管收集標本，1 h內上機檢測，并對細胞周期進行分析，實驗重復3次。細胞凋亡檢測時收集(1～5)×105個細胞，按照說明書進行操作。

1.3 統計學方法

應用SPSS16.0統計軟件對數據進行方差統計學分析。

2 結果

2.1 細胞增殖的檢測

MTT實驗結果顯示，各濃度塞來昔布對huh-7細胞增殖均有明顯抑制作用，而且隨著藥物濃度增高和作用時間延長，抑制率升高，表明其抑制作用具有時間及藥物濃度的依賴性(表1)。且塞來昔布從12.5 μmol/L至75 μmol/L，在同濃度下，作用72 h時抑制率明顯高于作用24、48 h，差異有統計學意義(P<0.05)。

表 1 MTT 法測定塞來昔布對huh-7肝癌細胞生長的抑制作用

2.2 細胞凋亡檢測

流式細胞儀檢測結果發現：huh-7細胞的自發凋亡率極低，藥物組凋亡率顯著高于對照組，提示此濃度的塞來昔布促進huh-7細胞凋亡；放療組凋亡率較對照組明顯提高，表明放療能夠誘導凋亡；聯合組凋亡率高于對照組，放療組與藥物組凋亡率比較，經統計學處理有顯著性差異，見表2。

表 2 作用48 h后各組huh-7細胞凋亡率情況

▲為與對照組比較，P<0.05；○為與藥物組比較，P=0.000；●為與放射組比較，P=0.000

2.3 細胞周期檢測

流式細胞儀檢測結果發現，各組均出現大小不一的凋亡峰，與對照組比較，藥物組G0/G1期細胞比例增大，S期細胞比例減小，而 G2/M變化不大；照射組G0/G1期細胞比例增大，S期細胞比例減小，而G2/M細胞比例增大；聯合組與藥物組比較，G0/G1期細胞比例減小，S期細胞比例增大，而G2/M期細胞比例增大；聯合組與放療組比較，G0/G1期細胞比例減小，S期細胞比例減小，而G2/M期細胞變化不大(表3)。

表3 作用48 h后各組 huh-7細胞周期情況

3 討論

有報道顯示[1]，COX-2在肝癌組織中表達，提示COX-2可能是腫瘤防治的1個新靶點[2]。塞來昔布(celecoxib)是用于臨床的COX-2選擇性抑制劑，本研究發現，用不同濃度塞來昔布作用于肝癌細胞株huh-7細胞后，對細胞生長增殖有明顯抑制作用，并且隨著濃度的增高,作用時間的延長，這種抑制作用更明顯，呈一定的劑量時間依賴關系，因此，塞來昔布有可能對肝癌細胞的發展有抑制作用。

流式細胞術檢測示，塞來昔布與放療均誘導凋亡，并且塞來昔布聯合放療對細胞凋亡有協同作用，提示塞來昔布有提高放療敏感性，與馮文峰等研究結果相符[3]。流式細胞術檢測示塞來昔布作用時,G1期受到

阻滯,阻滯細胞進入S期,從而抑制細胞增殖，與以往文獻報道的[4]相符。照射時G2期發生明顯阻滯與夏景光等[5]的研究結果相符。塞來昔布使對放療不敏感的S期細胞減少，影響細胞DNA的修復，可能是其放療增敏機制之一，具體機制需進一步研究。

綜上所述，塞來昔布能提高人肝癌細胞株huh-7放療敏感性作用，其作用可能是通過協同誘導細胞凋亡、改變細胞周期時相分布等機制來實現的。

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