索拉非尼對人卵巢癌SKOV-3細胞凋亡的影響

潘 敏 余進進 黃小艷 楊文霞 王會平

索拉非尼是首個口服的小分子多靶點抗腫瘤藥物，不僅可以抑制RAF 激酶，還能抑制血管內皮生長因子 -2(VEGFR-2)、血管內皮生長因子 - 3(VEGFR-3)以及血小板源生長因子-β(PDGFR-β )的酪氨酸激酶的活性，通過雙重機制抑制腫瘤生長，被稱為多激酶抑制劑[1]。本實驗研究索拉非尼與紫杉醇單獨給藥及兩藥不同給藥順序聯合給藥，對人卵巢癌SKOV-3細胞凋亡的影響，為動物實驗和臨床試驗提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人卵巢癌SKOV-3細胞株由無錫市第四人民醫院中心實驗室傳代保存；RPMI-1640、四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒、Annexin Ⅴ/PI雙染凋亡試劑盒、細胞周期試劑盒均購自南京凱基生物科技發展有限公司，標準新生牛血清購自杭州四季青生物公司；實驗藥物索拉非尼為德國拜耳公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人卵巢癌SKOV-3細胞培養在含10%新生牛血清及青、鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養基中，在37℃、5%CO2的飽和濕度恒溫培養箱中培養，2～3天換液1次，待細胞鋪滿瓶底70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代繼續培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT檢測索拉非尼作用于人卵巢癌SKOV-3細胞株的抑制率 取對數生長期細胞，以最適密度(5 000個/100 μL)接種于 96孔板，置于37℃含5%CO2的飽和濕度恒溫培養箱中繼續培養24 h，吸盡培養基，PBS洗兩遍，加入稀釋成不同濃度的藥物各100 μL，每組設置3個復孔，置培養箱中繼續培養，實驗中止前4 h每孔加入50 μL的1×MTT，繼續培養4 h，吸盡上清液，每孔加入DMSO 150 μL，微振蕩器上振蕩溶解10 min，以空白對照孔調零，在自動酶標儀490 nm波長處，測定每孔的吸光度(A)值。細胞抑制率(%)= 1-(實驗組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值) ×100%。實驗重復3次。

1.2.3 Hoechst染色觀察細胞凋亡 取對數生長期細胞，以最適濃度接種于96孔板，設陰性對照組及索拉非尼處理組(加藥濃度為3.0、6.0、12.0 μmol/L)，繼續培養細胞24 h，棄上清，加入適量Hoechst33258染液，室溫避光反應10 min，于熒光倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率變化 取對數生長期細胞，以50萬個/mL的濃度分別接種于100 ml的培養瓶中，共6組。①空白對照組：不加任何藥物，培養細胞48 h；②索拉非尼組：單獨用索拉非尼6 μmol/L，作用細胞24 h；③紫杉醇組：單獨用紫杉醇 0.008 μmol/L，作用細胞24 h；④索拉非尼序于紫杉醇組：先用索拉非尼作用細胞24 h，然后加入紫杉醇繼續作用細胞24 h；⑤紫杉醇序于索拉非尼組：先用紫杉醇作用細胞24 h，然后加入索拉非尼繼續作用細胞24 h；⑥索拉非尼和紫杉醇同時給藥組：同時用索拉非尼和紫杉醇作用細胞24 h。各實驗組經藥物處理后，用胰酶消化細胞制成單細胞懸液，按流式細胞檢測試劑盒說明書處理細胞，應用流式細胞儀進行檢測。實驗重復3次。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 索拉非尼作用于SKOV-3細胞株的抑制率

不同濃度、不同時間索拉非尼對SKOV-3細胞的抑制作用見圖1。索拉非尼對SKOV-3細胞有明顯抑制作用，且這種抑制作用隨著其濃度增高或作用時間延長而增強，呈顯著劑量和時間依賴性(P<0.05)。

圖1 不同濃度索拉非尼對SKOV-3細胞增殖抑制作用

2.2 Hoechst染色法觀察細胞凋亡情況

不同濃度索拉非尼處理細胞后，經Hoechst33258染色，熒光顯微鏡下觀察發現，正常對照組細胞的胞核熒光分布較均勻，呈淺藍色熒光；而索拉非尼處理24 h后的細胞，則出現不同程度核固縮、碎裂，形態不規則，并見凋亡小體，鏡下呈明亮藍色熒光，即典型細胞凋亡形態，其中索拉非尼濃度為12.0 μmol/L時較為明顯。

2.3 細胞周期及凋亡率變化

流式細胞儀檢測索拉非尼、紫杉醇單獨給藥及兩藥不同順序聯合給藥，對SKOV-3細胞細胞周期及凋亡率的影響。索拉非尼主要使細胞阻滯在S期，6個實驗組中，給藥組凋亡率均高于對照組，而其中以紫杉醇序于索拉非尼組凋亡率最高[(27.57±2.01)%]，顯著高于其他各組，差異有統計學意義(P<0.01)，而索拉非尼序于紫杉醇組的凋亡率[(9.73±1.15)%]，明顯低于紫杉醇序于索拉非尼組及兩藥同時加入組，但高于單獨給藥組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1和圖2。

3 討論

RAF/MEK/ERK 信號傳導通路是細胞周期調控、基因表達、細胞增殖和分化過程中的主要途徑，RAF為該通路中的關鍵激酶，與細胞增殖、分化及血管生成的調節密切相關，索拉非尼正是通過抑制RAF活性從而阻斷了RAF/MEK/ERK 信號傳導通路，抑制腫瘤細胞增殖，并且誘導腫瘤細胞凋亡。另一方面，腫瘤的生長和轉移依賴于新生血管的形成，VEGF和 PDGF是重要的促血管生成因子，索拉非尼通過抑制VEGFR-2、 VEGFR-3和PDGFR 酪氨酸激酶的活性，阻斷腫瘤血管生成，抑制腫瘤生長[1]。一些臨床研究顯示，索拉非尼在肝細胞癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤的治療中顯示了良好效果[2～4]。在慢性粒細胞白血病、多發性骨髓瘤、黑色素瘤等人類腫瘤的臨床前研究顯示，索拉非尼能顯著抑制腫瘤細胞生長，誘導腫瘤細胞凋亡，并呈現劑量依賴關系[5～7]。Noriomi等在卵巢透明細胞癌的裸鼠移植瘤模型的實驗結果顯示，索拉非尼能顯著抑制移植瘤的生長，且裸鼠體重無明顯影響，提示該藥對其無明顯毒性作用[8]。

表1 各組細胞周期及凋亡情況

圖2 各組細胞的細胞周期及凋亡情況

本實驗通過流式細胞儀檢測索拉非尼與紫杉醇不同給藥方式對SKOV-3細胞細胞周期及凋亡率的影響，結果顯示聯合給藥組的凋亡率均高于單獨給藥組及對照組，其中紫杉醇序予索拉非尼組凋亡率最高，而索拉非尼序予紫杉醇組的凋亡率明顯低于紫杉醇序予索拉非尼組及同時加入兩藥組，差異有統計學意義。在細胞周期的分析中發現，索拉非尼使細胞阻滯在S期，使大部分細胞不能進入下一個細胞周期，從而抑制細胞增殖并誘導其凋亡，與紫杉醇聯合給藥組中，發現各組的 G0/G1期細胞均呈不同程度減少，索拉非尼序予紫杉醇組S期顯著增加，G2期相對減少，可能與S期阻滯，不能進入G2期有關，紫杉醇序予索拉非尼組及同時加入兩藥組，S期和G2/M期增加，其中，后予索拉非尼組凋亡率最高，差異有統計學意義。由此推測，先予化療藥物的誘導后序予索拉非尼治療卵巢癌可能獲得理想的效果。

綜上所述，本實驗通過 MTT法發現索拉非尼顯著抑制SKOV-3細胞的增殖，且其抑制作用呈劑量和時間依賴性，Hoechst染色法及流式細胞儀檢測進一步證實索拉非尼能誘導SKOV-3細胞凋亡，在與卵巢癌一線化療藥物紫杉醇的聯合用藥中，發現先給予紫杉醇誘導后再予索拉非尼能夠獲得更高的凋亡率，提示在卵巢癌的臨床治療中，先予周期性化療誘導，再序貫給予分子靶向治療藥物可能是治療卵巢癌的最佳模式。

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[8] Noriomi Matsumura,Masaki Mandai,Takako Okamoto,et al.Sorafenib efficacy in ovarian clear cell carcinoma rerealed by transcriptome profiling〔J〕.Cancer Sci,2010,101(12):2658.