核磁共振法測定西洛他唑含量

楊金霞，姚婷玉，王健偉，張丹

(蘇州高新技術創業服務中心生物醫藥分析測試中心，江蘇蘇州 215011)

核磁共振法測定西洛他唑含量

楊金霞，姚婷玉，王健偉，張丹

(蘇州高新技術創業服務中心生物醫藥分析測試中心，江蘇蘇州 215011)

建立核磁共振（1H NMR）法測定西洛他唑含量的方法。采用Bruker Avance Ⅲ400 MHz核磁共振波譜儀，以1，2，4，5-四氯-3-硝基苯為內標，氘代氯仿為溶劑，zg30脈沖序列。對實驗參數如掃描次數、延遲時間等進行優化。西洛他唑質量在5～30 mg范圍內，樣品和內標物的積分面積比值與樣品和內標物的質量比值呈現良好的線性關系，線性相關系數r=0.995 3，測定結果的相對標準偏差小于0.4%（n=5)。該方法可用于藥品的質量控制和監管。

核磁共振法；西洛他唑；含量

西洛他唑（cilostazol）臨床上主要用于改善慢性動脈閉塞癥引起的缺血性癥狀，如潰瘍、肢痛、發冷及間歇性跛行［1］。經查閱相關文獻及國家藥品標準［2，3］，目前測定西洛他唑的方法有高效液相色譜法（HPLC），該法以甲醇-水為流動相，定量檢測需要對照品，且檢測時間較長。中國藥典2010年二部附錄Ⅸ［4］首次引入核磁共振波譜法，但沒有具體品種藥物的NMR定量方法。隨著現代儀器靈敏度的不斷提高，NMR定量法測定藥物含量將成為今后發展的趨勢［5，6］。

筆者采用1H NMR法測定西洛他唑含量，通過對西洛他唑結構(圖1)分析，選擇西洛他唑結構中5，7，8三個氫的吸收為特征峰，用已知純度的標準品1，2，4，5-四氯-3-硝基苯中1個氫為定量內標，根據核磁信號強度與質子數目成正比的特點對藥物進行定量分析［4］。該法簡便、專屬性較強，不需要西洛他唑對照品，對樣品無破壞，準確性、重復性較好。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

核磁共振波譜儀：Bruker Avance Ⅲ400 MHz型，瑞士Bruker公司；

圖1 西洛他唑化學結構式

BBO探頭：5 mm；

核磁管：內徑5 mm；

電子天平：XS205，d=0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司；

溶劑：CDCl3，氘代度 99.8%+0.03%TMS，美國CIL公司；

定量內標：1，2，4，5-四氯-3-硝基苯，批號421-7A，純度99.3%，美國Chem Service 公司；

西洛他唑原料：蘇州中化藥品工業有限公司。

1.2 實驗條件

采用zg30脈沖序列［7］；測定溫度（探頭溫度）：300 K；溶劑：CDCl3；采樣次數（NS）：8，TD=65 536；譜寬：8 012.82 Hz；脈沖寬度（P1）：10.60 μs；脈沖功率（PL1）：-2.00 dB；脈沖延遲時間（d1）：15 s；采樣時間（AQ）：4.0 894 966 s。

1.3 實驗方法

精密稱取西洛他唑30 mg和1，2，4，5-四氯-3-硝基苯10 mg置于直徑5 mm的核磁管中，加入1.0 mL CDCl3使其完全溶解，蓋上管帽，按1.2實驗條件進行氫譜檢測，調節儀器參數，勻場，采樣，圖譜處理，確定結構無誤后，選擇西洛他唑的特征峰（7.6≤δ≤ 7.8）和 1，2，4，5-四氯-3-硝基苯的單峰（6.6≤δ≤6.8）作為定量分析的特征峰，將其積分，取5次測定結果的平均值，按1.4中公式計算西洛他唑的含量。

1.4 結果計算

西洛他唑含量按下式計算：

式中：CS——待測樣品的含量；

mR——內標物的質量，mg；

AS，AR——樣品和內標物的定量特征峰積分面積；

ES，ER——樣品和內標物的定量特征峰質子當量質量（以分子量除以定量特征峰對應的質子數），Da；

CR——內標物的含量；

ms——樣品質量，mg。

2 結果與討論

2.1 溶劑的選擇

當選擇CDCl3為溶劑時，樣品和內標物能夠完全溶解，且溶劑峰（δ=7.72）與樣品的定量特征峰（δ=6.70）完全分離，不相互干擾，測定結果準確，因此選擇CDCl3為溶劑。

2.2 內標物的選擇

試驗發現，1，2，4，5-四氯-3-硝基苯只有一個特征參考峰（δ=7.74）與樣品西洛他唑的特征峰（δ=6.70）完全分離，而且這兩組峰與其它峰也能完全分開，峰兩側的基線平坦，其積分值比較準確，可作為定量分析的依據。因此選擇1，2，4，5-四氯-3-硝基苯為定量內標物。

2.3 樣品量的選擇

配制不同濃度的樣品進行分析，試驗結果顯示，樣品最低濃度為0.01 mol／L即可滿足檢測要求。

2.4 延遲時間d1的選擇

當d1≥5×T1（T1為縱向弛豫時間）才能保證在下次掃描時磁化矢量完全回到Z軸，否則對結果的影響較大。分別設置 d1=1，2，4，6，8，10，15，20，25 s ，進行試驗。結果發現，d1≤15 s時，隨著d1的增加，樣品和內標的峰面積比值逐漸增大；d1＞15 s時，樣品和內標物的峰面積比值沒有明顯變化，因此d1選擇15 s。

2.5 掃描次數NS的選擇

將掃描次數 NS 設定為 4，8，16，32，64，128，對樣品分別進行試驗，結果表明，掃描次數改變，樣品和內標物積分面積的比值沒有明顯變化，因此選擇NS=8。

2.6 工作曲線

精密稱取內標物24.8 mg ，置于5 mL容量瓶中，加適量CDCl3充分振搖使其完全溶解，用溶劑CDCl3定容至刻度，作為內標溶液；精密稱取西洛他唑 5.4，10.4，15.2，20.1，25.3，30.0 mg 分別加入到核磁管中，各加入內標溶液1.0 mL，使其完全溶解后，按1.2實驗條件進行氫譜檢測，對樣品和內標物的特征峰分別積分，每個濃度樣品的積分面積取3次測定結果的平均值，結果見表1。

表1 樣品與內標物的質量及其特征峰面積

利用樣品和內標物積分面積的比值（y）對樣品和內標物質量的比值（x）進行線性回歸，回歸方程為y=2.406 1x-0.523 6，相關系數r=0.995 9，線性范圍為 5.0～30.0 mg。

2.7 重復性試驗

按1.2實驗條件對批號為X21-002，X21-003樣品溶液（編號為1#，2#）進行測定，每個樣品重復測定5次，計算樣品和內標物的特征峰面積的比值，測定結果的相對標準偏差分別為0.12%，0.31%，由此可見方法的重復性較好。

表2 重復性試驗結果

2.8 穩定性試驗

將批號為X21-003的樣品溶液在室溫下分別放置 0，2，4，6，8，10，12，24 h 后進行測定，計算樣品和內標物特征峰面積的比值，8次測定結果的相對標準偏差為0.36%，表明樣品在24 h內放置穩定。

表3 穩定性試驗結果

2.9 樣品測定

取3批西洛他唑樣品分別用本法和標準方法（HPLC法）進行檢測，測定結果見表4。由表4可知，核磁共振法與標準方法的測定結果相符合。以1#樣品為例，樣品、內標物及溶劑的1H NMR譜圖見圖2。

表4 樣品測定結果

圖2 樣品、內標物及溶劑的1H NMR譜圖

2.10 其它影響因素

（1）為保證NMR定量結果的重現性和準確性，圖譜的處理很關鍵：首先要保證勻場要好，否則會造成半峰寬的加寬和峰型的變化，影響積分面積。勻場好壞的判斷標準為：氘代試劑中的內標物TMS除了出現尖銳的單峰外，在其峰的底部兩側各有一個小峰。相位調整要仔細，應將譜圖放大后調整峰形左、右輪廓線與水平的基線剛好重合，積分面積的起、止點每次要一致，基線要平直，并對該組峰面積的積分取5次測定結果的平均值，以減少誤差。

（2）為保證結果的準確性可以再選擇樣品的另一組信號峰以同樣的方法進行定量，然后以這兩組峰測量結果的平均值作為含量測定的結果,這樣更接近藥品含量的真實結果。

3 結語

采用NMR法測定西洛他唑藥品含量，測定結果的重復性及穩定性均較好，該方法具有快速、準確、簡單的特點。在被測樣品沒有高純度對照品或難以得到對照品的情況下，可以作為藥品含量測定的補充，在含量檢測的同時，對其結構進行確證（即藥物鑒定），這對防止假冒、偽劣藥品的出現具有極其重要的意義。

［1］Kambayashi J，Liu Y G，Sun B，et al. Ciloslazol as a unique antithrombotic agent ［J］. Curr Pharm Des 2003，9(28)：2 281-2 291.

［2］王存芳，嚴啟新，李勇.HPLC法測定西洛他唑含量［J］.中華醫學研究雜志，2006(1)： 21-22.

［3］YBH 05382004 西洛他唑［S］.

［4］國家藥典委員會.中國藥典［M］.二部：附錄.北京：中國醫藥科技出版社，2010.

［5］孫靜霞，張正行.NMR在藥物定量分析中的應用［J］.藥物分析雜志，2005，25(1)： 117-122.

［6］于小波，沈文斌，相秉仁.定量核磁共振技術及其在藥學領域的應用進展［J］.藥學進展，2010，34(1)： 17-24.

［7］張友杰，劉小鵬.藥物核磁共振定量分析參數研究［J］.波譜學雜志，2007，24(3)： 289-295.

Determination of Cilostazol by1H NMR

Yang Jinxia, Yao Tingyu, Wang Jianwei, Zhang Dan
（Analytical and Testing Center of Bio-Medicine in Suzhou New & High-Tech Innovation Service Center，Suzhou 215011， China ）

A method for the determination of cilostazol by1H NMR was established. Proton nuclearmagnetic resonance spectroscopy(1H NMR) spectra were obtained in CDCl3with the internal standard 1，2，4，5-tetr-achloro-3-nitrobenzene and zg30 pulse sequence by using Bruker AvanceⅢ400 MHz spectrometer. Testing parameters such as scanning number，delay time were optimized. Area ratio of sample and internal standard was linear with mass ratio of sample and internal standard in the range of 5.0-30 mg for cilostazol concentration,r=0.995 3. The relative standard deviation of detection results was less than 0.4%(n=5). This method is suitable for quality control and supervision.

NMR; cilostazol; content

O 657.2

A

1008-6145(2012)04-0068-03

10.3969／j.issn.1008-6145.2012.04.021

聯系人：楊金霞；E-mail： yjx@csibi.cn

2012-04-17