大鼠ZnT1基因重組腺病毒載體的構建及鑒定*

胡英明，梅晰凡△，宋長威，李 諶

(遼寧醫學院附屬第一醫院：1.骨科；2.中心實驗室,遼寧錦州 121000)

鋅轉運體-1(zinc transporter1，ZnT1) 是鋅轉運蛋白家族的重要成員之一,在調解機體鋅代謝以及神經活動過程中發揮著極其重要的作用[1]。研究顯示，ZnT1在正常鼠脊髓有少量的分布，在脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后顯著增加，且與腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達呈正相關，提示它可能是調控內源性BDNF表達量增加，促進損傷脊髓神經元及其軸突修復的主要原因[2-4]。然而，SCI后BDNF總量的增加不足以維持損傷處神經元的存活和軸突的再生，人們采用外源性BDNF來修復SCI雖然取得了一定的療效[5-7]，但是，外源性BDNF存在著宿主排斥反應、難以通過血腦屏障以及基因治療的長期安全性等問題。如果能尋找出調控內源性BDNF及其受體表達的有效途徑，促進內源性BDNF的合成、釋放及與受體結合，將在體內建立有效的保護機制，從而減輕脊髓繼發性損傷。由Invitrogen公司開發的GatewayTM技術是一種基于λ噬菌體位點特異性重組系統，能夠快速地、特異性地將一個或多個目的基因片斷克隆到入門載體[8-9]，該技術大大地簡化了基因克隆的步驟，且效率高達95%或以上[10]。本研究采用GatewayTM技術構建大鼠ZnT1基因重組腺病毒載體，為下一步研究ZnT1基因在脊髓神經細胞中的表達以及與BDNF/TrkB信號調節通路的關系奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1材料 目的基因片段ZnT1/IRES/EGFP委托賽業(廣州)生物科技有限公司化學合成；pDonr221載體供體、pDown入門載體、Ad/CMV/V5-DEST載體、BP ClonaseTM酶、LR ClonaseTM酶Invitrogen公司；PacⅠ、EcoRⅤ、NdeⅠ、BstBⅠNEB公司；質粒大提試劑盒、質粒小提試劑盒購自Promega公司；HEK293A細胞由本實驗室保存； DNA Marker、DMEM培養基及胎牛血清購自Hyclone公司。

1.2方法

1.2.1含重組位點attB目的基因片段的獲取 在GenBank中檢索大鼠ZnT1cds序列，委托賽業(廣州)生物科技有限公司化學合成ZnT1/RES/EGFP目的基因片段，采用PCR方法在該基因片段兩側添加attB重組特異位點，重疊延伸PCR技術擴增基因片段attB1-ZnT1/IRES/EGFP-attB2，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，反應產物參照QIAquick的瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒進行回收，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2入門克隆的構建 將2 μL目的基因片段、2 μL含有attP位點pDonor221供體載體、1 μL BP ClonaseTM酶和適量TE緩沖液混合25 ℃，BP反應3 h，加入蛋白酶K終止反應10 min，取反應終產物轉化感受態大腸桿菌Stbl3，轉化物涂到含有卡那霉素的LB培養基，37 ℃孵育過夜，無菌操作下挑取單個陽性克隆，小量提取質粒，并對提取質粒進行EcoRⅤ酶切篩選并送交陽性克隆進行測序,測序引物為：Forward，5′-CGG CCA GTC TTA AGC TCG GG-3′；Reverse，5′-AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGA-3′。將正確克隆命名為pDown-ZnT1。

1.2.3表達克隆的構建 將1 μL入門克隆產物，1 μL目的載體Ad/CMV/V5-DEST,1 μL的 LR ClonaseTM酶，2 μL的TE緩沖液混合，25 ℃，LR反應16 h，使入門克隆與目的載體發生體外特異位點重組。取反應終產物轉化感受態大腸埃希菌Stbl3，轉化物涂到含有氨芐霉素的LB培養基，無菌操作下挑取單個陽性克隆，小量提取質粒，NdeⅠ和BstBⅠ酶切篩選送交陽性克隆測序鑒定，序引物為：Forward，5′-GAA CCC ACT GCT TAC TGG CTT-3′；Reverse，5′-AGA CCG AGG AGA GGG T-3′。將重組后質粒命名為pAd -ZnT1。

1.2.4重組腺病毒載體的包裝與擴增 HEK293A細胞的準備：轉染前將處于對數生長期的HEK293A細胞用0.25% 胰蛋白酶消化，含體積分數10%FBS的DMEM完全培養基調整細胞密度為30%～40%，重新接種于25 cm2的細胞培養瓶，37 ℃、體積分數5% CO2培養箱內培養，待細胞密度達60%～70%時即可用于轉染。細胞狀處于對數生長期及較少的傳代次數對于病毒包裝至關重要。

重組腺病毒顆粒的形成：用質粒大提試劑盒提取質粒，PacⅠ酶切使其線性化，暴露病毒的ITRs端(inverted terminal repeat sequence，病毒基因組復制所需的重復序列)，采用酚/仿異戊醇抽提法提純質粒DNA，在Lipofectamine 2000轉染試劑的介導下轉染HEK293A細胞，當有明顯的細胞病態反應(CPE)現象，且有大于50%細胞脫壁時即收集細胞。于-80 ℃深低溫冰柜中30 min，37 ℃恒溫水浴箱中20 min反復凍融3次，室溫下1 000 r/min離心3 min，獲得重組腺病毒顆粒Ad-ZnT1上清液即為原代病毒液，取部分原代病毒液再次感染HEK293A細胞，獲得較高滴度第2代病毒，如此獲得高滴度的第3代病毒液。

重組腺病毒的滴度測定：病毒滴度測定采用終點稀釋法。檢測前24 h在96孔平底培養板內，每孔加入100 μL約含104個HEK293A細胞的懸液(含5% FBS的DMEM)，37 ℃，5% CO2培養箱中孵育待用。取第3代腺病毒病毒液10 μL加入含有990 μL DMEM的EP管內作1∶100稀釋，濃度即為原病毒液的10-2，以此濃度為起點，作病毒液的1∶10倍比稀釋，即成10-3～10-10各種梯度濃度的病毒稀釋液。從細胞培養箱中取出96孔板，確定每孔的細胞均生長良好，吸棄舊培養液，然后依次將10-3～10-10稀釋的病毒液加入96孔板中，每一稀釋度占用一行。每一行前10孔加入100 μL病毒稀釋液，第11、12孔均加入100 μL不含病毒的完全培養基作為對照。培養10 d左右，觀察CPE現象，并對CPE孔進行計數。計算每一行的陽性率，計算病毒滴度(Spearman-Karber Method):病毒滴度=10(X+0.8)pfu/mL。

1.2.5Western blotting分析重組腺病毒Ad-ZnT1的表達 實驗組(Ad-ZnT1)、陰性對照組(Ad-EGFP)用最佳感染復數(MOI=100)感染HEK293A細胞，第3組為正常細胞。48 h后將培養液棄掉，預冷的PBS輕洗3次。收集細胞，通過反復凍融法裂解細胞獲取蛋白。紫外分光光度計法測定提取的蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳法制備蛋白膠(體積分數5%濃縮液，10%分離膠) 電泳,將蛋白膠轉移至PVDF膜上。用麗春紅染液染色，經5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗兔抗鼠ZnT1(稀釋比例為1∶500)孵育1 h，TBST中洗滌3次，繼續用HRP標記的二抗羊抗兔(稀釋比例為1∶5 000)孵育1 h，ECL試劑盒顯色，通過觀察重組腺病毒目的蛋白表達情況。

2 結 果

2.1含attB位點基因片段合成的鑒定 PCR擴增attB1-ZnT1第1外顯子、attB1-ZnT1第2外顯子、IRES/EGFP-attB2基因片段(圖1)，1%瓊脂糖凝膠進行電泳，泳道1、2、3分別是PCR擴增第1外顯子約0.6 kb，第2外顯子約0.9 kb，IRES/EGFP-attB2片段約1.3 kb，重疊延伸PCR后擴增基因片段attB1-ZnT1/IRES/EGFP-attB2 電泳，片段大小約2.8 kb，為前三者之和，證實含有attB特異位點的目的基因片段完成連接，見圖2。

圖1 含attB特異位點基因片段的PCR擴增

圖2 含attB特異位點基因片段的PCR重疊延伸擴增

2.2入門克隆的酶切篩選和測序鑒定 以EcoRⅤ酶切篩選入門克隆pDown-ZnT1，泳道1～3分別是不同克隆后的酶切結果，1%瓊脂糖凝膠電泳。泳道3可見有大小約為1.9 kb和 3.3 kb的目的片段，小片段是入門載體pDown骨架部分，這與入門載體骨架大小相符，大片段為含特異位點基因片段部分(圖3)。選取泳道3克隆測序鑒定(封2圖4)，證實目的基因已經克隆至入門載體中。

圖3 EcoRⅤ酶切篩選陽性入門克隆pDown-ZnT1

2.3重組腺病毒載體的酶切篩選和測序鑒定 重組腺病毒表達載體經NdeⅠ、BstBⅠ雙酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳，可見約3.3 kb處有目的條帶的強表達(圖5)，該條帶與入門載體酶切篩選結果基本符合，證實經過LR反應后含有attB特異位點的attB1-ZnT1/IRES/EGFP-attB2基因片段已克隆至表達載體中。送交陽性克隆測序鑒定(封2圖6)，目的基因ZnT1克隆至表達載體中。

圖5 重組腺病毒表達載體經NdeⅠ和BstBⅠ雙酶切

2.4重組腺病毒滴度的測定 重組腺病毒pAd-CMV-ZnT1/IRES/EGFP按上述終點稀釋實驗法測得各排陽性孔的比率(10-3～10-10梯度稀釋度)分別為1、1、1、0.9、0.7、0.6、0.2、0，X=1+1+1+1+1+0.9+0.7+0.6+0.2+0=7.4，按照(Spearman-Karber Method)方法：毒滴度(pfu/mL)=10(X+0.8)=10(1+1+1+1+1+0.9+0.7+0.6+0.2+0.8)=1.6×108pfu/mL。同理獲得陰性對照腺病毒Ad-ZnT1滴度為2.5×108pfu/mL。

2.5重組腺病毒感染HEK293A細胞的熒光表達 重組腺病毒Ad-ZnT1感染HEK293A細胞后，隨著時間的延長，正常的多角形HEK293A細胞皺縮變小，細胞間隙變大，多個細胞聚集呈現葡萄串樣改變，熒光顯微鏡下觀察可見明顯的熒光，見封2圖7。

2.6腺病毒介導的ZnT1基因在HEK293A細胞中的表達 目的基因ZnT1表達蛋白相對分子質量為36×103，實驗組(A組)、陰性對照組(B組)感染HEK293A細胞后48 h，Western blotting結果顯示A組出現ZnT1特異條帶(圖8)，陰性B組及正常細胞組均未出現特異條帶。證實重組腺病毒Ad-ZnT1可高效感染293A細胞，并有目的基因ZnT1的強表達。

圖8 Western blotting分析目的基因ZnT1蛋白的表達

3 討 論

目前，基因治療中常用的生物病毒載體有重組逆轉錄病毒載體、重組慢病毒載體及重組腺病毒載體，其中重組腺病毒載體具有宿主范圍廣，外源性基因插入容量大，病毒滴度高，不整合于宿主基因組，包裝相對容易，能夠大量擴增及構建成本低等優點,腺病毒能感染幾乎所有的細胞類型,除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細胞[11-12]，這對于研究目的基因在神經細胞中的表達很有意義。

目前，大多采用Adeasy系統來構建重組腺病毒載體，該系統在設計引物時，添加了實驗所需的酶切位點并在位點前加保護堿基，先將目的基因和穿梭載體分別進行雙酶切鑒定，再由連接酶進行連接、轉化、篩選穿梭載體，酶切線性化后和病毒骨架Adeasy在大腸埃希菌BJl83感受態細胞中同源重組，挑選陽性克隆，酶切及測序鑒定后在293細胞中包裝，整個過程需要多次酶切，連接和轉化篩選并且重組陽性率很低，耗時長、工作繁瑣。

本實驗采用GatewayTM技術構建ZnT1腺病毒表達載體，在此技術中起到重組作用的位點有attB、attP、attL、attR。實驗中將含有attB位點的基因片段與attP位點的供體載體pDonr221在BP ClonaseⅡ高效酶催化下生成帶有attL位點的入門載體pDown-ZnT1。入門載體再與帶有attR位點的目的載體Ad/CMV/V5-DEST在LR ClonaseⅡ高效酶催化下生成表達載體pAd-ZnT1[13]。構建過程基于上述位點特異重組不再需要限制性內切酶和連接酶的參與，同時DNA片段的閱讀框和方向保持不變，這種新的表達更便利、省時。本實驗構建ZnT1不是用來直接進行基因治療，而是通過目的基因在真核細胞中表達上調，檢測BDNF及其受體TrkB的表達情況，為SCI尋找內部自身保護性因子，從而為SCI的修復及軸突再生提供理論依據。

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