Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 和Streptococcus thermophilus接種比例對Bifidobacterium lactis益生菌發酵乳品質的影響

李慧，白梅，王記成，魏愛彬，孔亞楠，張和平，孫天松

（內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018）

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 和Streptococcus thermophilus接種比例對Bifidobacterium lactis益生菌發酵乳品質的影響

李慧，白梅，王記成，魏愛彬，孔亞楠，張和平，孫天松

（內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018）

將Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02（LB-ND02）和Streptococcus thermophilusND03（ST-ND03）按1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000接種于脫脂乳中，同時接入益生菌Bifidobacterium lactisV9（B.lactisV9，接種量為2.0×107g-1），于42℃進行發酵。通過對發酵及貯藏過程中發酵乳指標的測定，評價LB-ND02和ST-ND03的接種比例對發酵乳品質的影響。結果表明，隨著LB-ND02接種比例減小，凝乳時間顯著延長，B.lactisV9活菌數顯著提高。4℃貯藏28 d后，隨LB-ND02接種比例減小，B.lactisV9存活率差異顯著，后酸化也顯著減弱。研究發現，LB-ND02和ST-ND03的接種比例，顯著影響發酵乳的發酵時間、B.lactisV9活菌數、后酸化及黏度。

Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02；Streptococcus thermophilusND03；Bifidobacterium lactisV9；益生菌發酵乳品質

0 引言

益生菌發酵乳品質受發酵劑、發酵溫度、發酵時間、貯藏條件等因素影響[1]。酸度、黏度、持水性、益生菌活菌數等是評價發酵乳品質的重要指標，尤其是益生菌的活菌數，是發揮益生特性的重要保證[2-3]。已發現貨架期內一些產品中益生菌的活菌數低于106g-1[4-7]。研究表明，菌株特性、后酸化、發酵劑、溶氧量及貯藏條件等對其活菌數均有影響[8-11]。

Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02和Streptococcus thermophilusND03分離自傳統發酵乳制品，并完成了基因組全序列測定，二者具有應用于發酵乳中良好的潛質[12-13]。Bifidobacterium lactisV9（B.lactisV9）分離自健康蒙古族兒童糞便，具有良好益生特性的益生菌，已經完成的基因全序列的測定[14-17]。

本研究通過改變保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的接種比例，探討其對益生菌發酵乳品質的影響。

1 實驗

1.1 材料和儀器

Bifidobacterium lactisV9、Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02、Streptococcus thermophilusND03均為直投式發酵劑。脫脂乳粉。

MRS合成培養基，Eppendorf TGL-168高速臺式離心機，pH計（雷磁PHS-3C，生化培養箱(LRH-250)，無菌工作臺（NSC-ⅡA-1200），全自動高壓滅菌器（HIRAYAMA HA-300M），Brookfield DV-1 VISCOMETER黏度儀。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

將脫脂乳粉于45～50℃軟化水中完全溶解，制成質量分數為11%還原乳，95℃5min殺菌，冷卻至42℃，按表1的接種量接入LB-ND02和ST-ND03，并以2.0× 107g-1接入B.lactisV9，于42℃恒溫發酵至pH值4.5終止發酵，4℃貯藏28 d。

表1 發酵乳中LB-ND02和ST-ND03的接種量（g-1）

1.2.2 發酵乳發酵及貯藏特性

發酵乳在42℃發酵及4℃28 d貯藏過程中，定期取樣測定發酵乳樣品pH值、滴定酸度（TA）、游離氨基氮（FAN）濃度、黏度、脫水收縮性及活菌數。

1.2.2.1 pH值測定

調整試驗樣品溫度至20℃，采用精密pH計（雷磁PHS-3C）測量。

pH降低率：pH-DR=（pH始-pH終）/發酵時間。

1.2.2.2 滴定酸度測定

滴定酸度按GB5413.34-2010中方法測定[18]。

滴定酸度增加率為TA-IR=（TA終-TA始）/發酵時間。

1.2.2.3 游離氨基氮含量測定

游離氨基氮（FAN）的測定采用鄰苯二甲醛衍生比色法，參照Lemieux[19]和Church[20]等人的方法。

游離氨基氮增加率：FAN-IR=（FAN終-FAN始）/發酵時間。

1.2.2.4 黏度測定

調整發酵乳樣品溫度至20℃，采用Brookfield DV-1 VISCOMETER黏度儀(Brookfield Engineering Laboratories,Inc,Middleboro,MA)4#轉子進行測定，其中轉子轉速為100 r/min，扭矩為10%～100%，測定時間為30 s。

1.2.2.5 脫水收縮性的測定

稱取20.0 g發酵乳樣品，置于帶有濾紙（雙圈牌中速定性濾紙）的漏斗中，4℃放置120 min，收集濾液并稱重[21]。

脫水收縮性（%）=（濾液質量/樣品質量）×100。

1.2.2.6 活菌數測定

取1.0 g發酵乳樣品用滅菌PBS水溶液（質量分數0.8%的NaCl，0.02%的KH2PO4，0.115%的Na2HPO4，0.05%的半胱氨酸）梯度稀釋至一定倍數后，分別采用選擇培養基平板傾注法測定LB-ND02、ST-ND03和B.lactisV9的活菌數。

Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02的選擇培養采用文獻[22]中的方法，MRS固體培養基，調節pH值為4.58，43℃厭氧培養72 h。

Streptococcus thermophilusND03的選擇培養采用文獻[23]中的方法，ST固體培養基，37℃需氧培養24 h。

B.lactisV9的選擇培養采用國標GB 4789.35-2010中改良MRS固體培養基平板傾注法[24]，37℃厭氧培養72 h。

1.3 數據統計分析

每個指標的測定均做3個平行樣，采用SAS軟件的ANOVA程序進行方差分析，采用origin7.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 發酵期間及發酵終點不同接種比例對發酵乳品質的影響

LB-ND02與ST-ND03不同接種比例發酵乳在發酵期間pH值降低率（pH-DR）、滴定酸度增加率（TAIR）、游離氨基氮增加率（FAN-IR）及發酵時間、發酵終點酸度（TA終）、發酵終點游離氨基氮（FAN終）、發酵終點活菌數見表2。

隨LB-ND02接種比例的逐漸減小，發酵乳pH值降低率、滴定酸度增加率和游離氨基氮增加率顯著減小（P＜0.05），發酵至終點（pH值為4.5）所需時間顯著延長（P＜0.05），發酵至終點B.lactisV9活菌數顯著增大（P＜0.05）。其中LB-ND02與ST-ND03按1∶1000和1∶100接種時，發酵終點發酵乳中B.lactisV9活菌數（對數值）分別為（8.32±0.02）g-1和（8.01±0.04）g-1，較接種時（7.30 g-1，對數值）分別增加10倍和5倍，而按比例為1∶10接種時活菌數基本沒有變化。由此可見，降低LBND02的接種量，使發酵乳酸化速率減緩，發酵時間延長，增加了B.lactisV9活菌數。

眾所周知，與兩者單獨培養相比，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合培養后的產酸速度非?？欤驗榛旌吓囵B過程將促進兩者維持更好的生長[1]。Pette等人[25]證實保加利亞乳桿菌發酵乳中無菌過濾物可以促進嗜熱鏈球菌的生長。進一步研究得出，刺激嗜熱鏈球菌生長的這種過濾物中富含氨基酸。而嗜熱鏈球菌生長產生的嘌呤、嘧啶、CO2、甲酸、草酰乙酸、富馬酸等可刺激保加利亞乳桿菌生長[1]。因此，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例會影響二者在發酵乳中的共生關系，從而影響產酸速率和發酵時間。本研究中，改變LB-ND02與ST-ND03的接種比例，顯著影響了發酵時間。這是由于降低LB-ND02的接種量時，其水解蛋白產生的游離氨基酸濃度減少，使與ST-ND03的共生能力趨于減緩，產酸較慢，發酵時間延長。

表2 發酵乳在發酵期間和發酵終點（pH4.5）酸度、FAN、發酵時間及活菌數結果(n=3,x±SD)

已有研究表明，雙歧桿菌因缺少蛋白質水解活性，在乳中的生長受到一定限制，增加蛋白質水解物或與蛋白質水解能力強的菌株混合發酵，其活菌數可以得到有效的提高[26]。本研究中，LB-ND02與ST-ND03按1∶1接種時，發酵結束B.lactisV9活菌數（7.15 g-1，對數值）較接種時（7.30 g-1，對數值）略有降低。雖然此接種比例下較高的游離氨基氮可供B.lactisV9利用，但由于發酵時間（330 min）較短，B.lactisV9的生長受到限制；另一原因可能為LB-ND02產生的過氧化氫抑制了B.lactisV9的生長。Gilliland和Speck研究表明，保加利亞乳桿菌生長過程中會產生過氧化氫，過氧化氫會抑制雙歧桿菌糖代謝的關鍵酶—果糖-6-磷酸-磷酸酮酶（F6ppk），從而引起氧中毒[9]。從表2可知，當LBND02與ST-ND03按1∶1000和1∶100接種時，發酵結束B. lactisV9的活菌數較高，這是由于此比例下，較少的LBND02接種量，對B.lactisV9的影響較小，且蛋白水解能力有限，使發酵乳中游離氨基氮濃度較低，延長了發酵時間，B.lactisV9得到了較好的生長。

2.2 貯藏期間不同接種比例對發酵乳品質的影響

LB-ND02與ST-ND03不同接種比例發酵乳在4℃貯藏28 d后pH值降低量、滴定酸度增加量如表3所示。由表3可以看出，隨LB-ND02接種比例減小，貯藏28 d后發酵乳pH值降低量和TA增加量顯著減?。≒＜0.05）?？梢?，減少LB-ND02的接種量，可減緩發酵乳的后酸化現象。后酸化現象對發酵乳的品質影響巨大，最直接的后果是導致發酵乳無法長期貯存，影響其正常消費。保加利亞乳桿菌細胞壁或細胞膜對乳糖酶活性有一定的保護作用，因此造成發酵乳在貯藏過程中乳糖繼續被利用，導致了后酸化現象發生[27]。本研究中，LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶1和1∶10發酵乳后酸化較強，不僅與其中LB-ND02接種量大有關，還與其發酵結束游離氨基氮濃度高有關，因為較高的游離氨基氮濃度會刺激ST-ND03的進一步生長代謝，促進酸的生成。LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶1000和1∶100發酵乳后酸化現象較輕，可滿足實際生產需求。

LB-ND02與ST-ND03不同接種比例發酵乳在4℃貯藏28 d期間黏度和脫水收縮性變化如圖1和圖2所示。發酵乳黏度呈波動下降趨勢，其中，LB-ND02和ST-ND03接種比例為1∶1時，發酵乳黏度顯著低于其他組（P＜0.05）。發酵乳的脫水收縮性均有輕微上升，但無顯著性的差異（P＞0.05）。可見，除LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶1外，其他接種比例不影響發酵乳的黏度；所有接種比例并不影響發酵乳脫水收縮性。發酵過程中發酵劑產生的胞外多糖類黏性物質，有助于改善發酵乳的組織狀態和黏稠度，特別是在發酵乳干物質含量不太高時尤為重要[1]。本研究中，LBND02與ST-ND03按1∶1比例接種，發酵乳黏度低于其他比例組，這是由于ST-ND03的接種量（1.1×106g-1）較其他比例組（2.2×106g-1）低的緣故。秦南冰等也得到類似的結果，他們發現增加嗜熱鏈球菌接種量可增加發酵乳黏度[28]。脫水收縮性是發酵乳凝膠對各種乳成分尤其是水分的結合能力，這種結合能力包括對結合水和凝膠立體網絡中自由水的結合能力，脫水收縮性越小說明凝膠在規定的時間內失去的乳清越少[1]。脫水收縮性與發酵劑接種量有關，較大的接種量會使發酵乳產酸加快，蛋白水合能力減弱，導致貯藏過程中乳清析出[1]。本研究中所有比例組發酵乳脫水收縮性沒有差異，這是由于各比例組LB-ND02與STND03的初始接種量相同，發酵結束各比例組中LBND02與ST-ND03的活菌總數（見表2）基本相同。

LB-ND02與ST-ND03不同接種比例發酵乳在4℃貯藏28 d后LB-ND02、ST-ND03和B.lactisV9存活率如表3所示。LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶100發酵乳中，LB-ND02和ST-ND03的存活率（41.69%±0.14%和77.62%±0.20%）顯著高于其他比例組（P＜0.05）。LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶1發酵乳中B.lactisV9的存活率（23.44%±0.23%）顯著低于其他組（分別為91.20%±0.46%，85.11%±0.52%，79.43% ±0.33%）（P＜0.05）。發酵乳中乳酸菌的活菌數在貨架期內必須保持一定數量，本研究中LB-ND02與STND03接種比例為1∶100發酵乳中，LB-ND02和STND03的存活率最高，有應用于實際生產中良好潛力。本研究中LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶1發酵乳中B.lactisV9的存活率很低，這是由于發酵時間較短，B.lactisV9沒有得到充分生長，加上后酸化影響，故其存活率最低。而其他接種比例組中B.lactisV9的存活率并沒有隨其后酸化減弱而增高，可見后酸化并不是造成B.lactisV9死亡的主要原因。如前所述，可能是發酵乳中過氧化氫累積造成B.lactisV9的死亡，但是本研究中沒有對發酵乳中過氧化氫質量分數進行測定，是否由此導致B.lactisV9活菌數下降，有待進一步研究。雖然LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶10發酵乳中B.lactisV9存活率最高，但由于發酵時間較短，發酵結束活菌數較低（見表2），實際生產中受到局限。LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶1000和1∶100發酵乳中B.lactisV9存活率在80%左右，且發酵結束其活菌數增加5-10倍（見表2），綜合發酵所用時間考慮，LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶100時，更適于實際生產應用。

4 結論

本研究通過對發酵乳的酸度、黏度、脫水收縮性、FAN及活菌數的測定，評價LB-ND02和ST-ND03的接種比例對B.lactisV9益生菌發酵乳品質的影響。研究發現，LB-ND02和ST-ND03的接種比例，顯著影響發酵乳的發酵時間、B.lactisV9活菌數、后酸化及黏度。當降低LB-ND02接種量時，可提高B.lactisV9的活菌數，減輕發酵乳后酸化現象。綜合結果分析，當LBND02與ST-ND03接種比例為1∶100時，發酵乳發酵時間適宜、發酵結束B.lactisV9活菌數較高，貯藏期間后酸化較輕、B.lactisV9存活率較高，可應用于實際生產。

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Effects of inoculum ratios of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and Streptococcus thermophilus on the quality of probiotic fermented milk by Bifidobacterium lactis

LI Hui,BAI Mei,WANG Ji-cheng,WEI Ai-bin,KONG Ya-nan,ZHANG He-ping,SUN Tian-song
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineer,Education Ministry of China,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China)

Different ratios(1∶1,1∶10,1∶100,1∶1000)ofLactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02(LB-ND02)andStreptococcus thermophilusND03(ST-ND03)plus withBifidobacterium lactisV9(B.lactisV9,2.0×107g-1)were used as starter cultures for milk fermentation.Some indexs of prepared probiotic fermented milk were determined for evaluation for effect of different ratios of inoculum on the quality of probiotic fermented milk during the fermentation and storage.The results showed the fermentation time was significantly prolonged,viable numbers ofB. lactisV9 was significantly increased.After the fermentation followed by a 28 d storage,the survival ofB.lactisV9 were significantly different and the postacidifition was weakened as the ratio of LB-ND02 decreased..It is suggested that different ratios of LB-ND02 and ST-ND03 significantly influence the fermentation time,viable numbers ofB.lactisV9,postacidifition and visicosity during the fermentation and storage.

Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02;Streptococcus thermophilusND03;Bifidobacterium lactisV9;Quality of probiotic fermented milk

TS252.54，Q93-33

A

1001-2230（2012）03-0007-04

2011-11-07

國家高技術研究發展計劃（NO.2011AA100901，2011AA100902）；現代農業產業技術體系建設項目資助（No.nycytx-0501）；內蒙古自治區自然科學基金（2010Zd17）。

李慧(1987-)，女，碩士研究生，從事乳制品科學方面的研究。

孫天松