植物乳桿菌C88發(fā)酵特性研究

于志會，侯聚敏，李達(dá)，王昕，楊貞耐,

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，長春 130022；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林 132101；3.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，長春 130033)

植物乳桿菌C88發(fā)酵特性研究

于志會1,2，侯聚敏1，李達(dá)3，王昕1，楊貞耐1,3

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，長春 130022；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林 132101；3.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，長春 130033)

對一株本實(shí)驗(yàn)室篩選的益生菌植物乳桿菌C88的發(fā)酵特性進(jìn)行了研究，以一株商業(yè)化益生菌L.rhamnosusGG為參照。結(jié)果表明，菌株C88的凝乳活性較弱，蛋白水解活性較高；4℃貯28 d，該菌株表現(xiàn)出良好的存活能力，活菌數(shù)高于L.rhamnosusGG。菌株C88對金黃色葡萄球菌的抑制作用較強(qiáng)；丙酸鈣對其生長無顯著影響；藥敏實(shí)驗(yàn)表明該菌株對所選10種抗生素均表現(xiàn)出一定的耐藥性；本研究對植物乳桿菌C88發(fā)酵特性的研究為其進(jìn)一步應(yīng)用于益生性發(fā)酵乳的研究開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

益生菌；植物乳桿菌；發(fā)酵特性

0 引言

益生菌是指通過攝取適當(dāng)?shù)牧?對食用者的身體健康能發(fā)揮有效作用的活菌[1]。益生菌在激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)[2]、緩解腸道炎癥[3]、降低膽固醇[4]等方面發(fā)揮重要作用。益生菌作為附屬發(fā)酵劑添加到發(fā)酵乳制品中，不僅可以增加發(fā)酵乳制品的保健功效，而且還可以改善其品質(zhì)，賦予其獨(dú)特的風(fēng)味[5]。但是大多數(shù)益生菌在發(fā)酵乳制品貨架期內(nèi)的存活能力較差.同時(shí)由于抗生素的廣泛使用，細(xì)菌的耐藥性問題已日益凸顯。因此，為了合理開發(fā)應(yīng)用益生菌產(chǎn)品，對用于發(fā)酵劑的菌株發(fā)酵特性包括菌株的藥敏性和抑菌作用進(jìn)行全面了解是至關(guān)重要的。

本研究試驗(yàn)菌株C88由本實(shí)驗(yàn)室從內(nèi)蒙古奶豆腐中分離得到，經(jīng)API鑒定，確定為植物乳桿菌。本實(shí)驗(yàn)研究的目的在于通過與世界上公認(rèn)的商業(yè)用益生菌菌株L.rhamnosusGG的比較，對其在發(fā)酵乳中發(fā)酵特性進(jìn)行評價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

（1）試驗(yàn)菌株。植物乳桿菌C88、鼠李糖乳桿菌LGG為本試驗(yàn)室保藏菌種；致病菌。

（2）培養(yǎng)基。MRS液體培養(yǎng)基和MRS固體培養(yǎng)基按文獻(xiàn)方法配制[6]。

（3）主要儀器及試劑。Thermo CR3i高速冷凍離心機(jī)，PB-10數(shù)顯pH計(jì)，紫外可見分光光度計(jì)(Cary300)。脫脂乳粉(進(jìn)口)，酪氨酸,山梨酸鉀,所有化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵過程酸度和蛋白水解活性變化

將活化好的菌種按7 mL-1（對數(shù)值）接種量接種于10%(w/v)的脫脂乳中，在37℃下培養(yǎng)24 h，采用未接菌的10%(w/v)的脫脂乳作為空白。在0-24 h發(fā)酵期間每隔3 h測定發(fā)酵乳樣品滴定酸度和蛋白水解活性（采用OPA法[7]），對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出蛋白水解活性相當(dāng)于酪氨酸的量。鼠李糖乳桿菌LGG作為對照。

1.2.2 發(fā)酵冷藏期間酸度變化和存活能力

將活化好的菌種按7 mL-1（對數(shù)值）的接種量接種到質(zhì)量濃度為100 g/L脫脂乳中，于37℃發(fā)酵24 h后，轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中冷藏28 d。采用MRS瓊脂培養(yǎng)基(pH=6.6)平板計(jì)數(shù)法，測定發(fā)酵乳4℃冷藏期間第1，7，14，21，28 d的活菌數(shù)。同時(shí)，測定發(fā)酵乳樣品在冷藏期酸度變化。

1.2.3 植物乳桿菌C88凝乳活性

配制質(zhì)量濃度為100 g/L脫脂乳(RSM)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%酵母粉的100 g/L脫脂乳(RSM-YE)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%水解酪蛋白的100 g/L脫脂乳(RSM-CH)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%蛋白胨的100 g/L脫脂乳(RSM-P)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%葡萄糖的100 g/L脫脂乳(RSM-G)。植物乳桿菌C88按體積分?jǐn)?shù)為2%接種量接種于各脫脂乳中，于42℃培養(yǎng)16 h后，觀察是否凝乳。

1.2.4 植物乳桿菌C88抑菌活性測定

采用改進(jìn)的Hechard等[8]的瓊脂平板擴(kuò)散法。選取4株常見的致病菌：金黃色葡萄球菌CMCC26071、大腸桿菌CMCC44825、福氏志賀氏菌CMCC51061、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115分別接種到適宜的瓊脂培養(yǎng)基上，無菌條件下放置2 h。待瓊脂板凝固后用直徑為8 mm的牛津杯在瓊脂培養(yǎng)基上打孔。將活化好的菌株離心（10 000 g，4℃，10 min），收集上清液備用。為了排除有機(jī)酸的干擾，上清液應(yīng)經(jīng)微孔濾膜過濾后份兩組，一組不調(diào)pH值，一組調(diào)pH值為6.5。分別取處理過的上清液50 μL加入到瓊脂板上的孔中，37℃培養(yǎng)48 h。用直尺測量抑菌圈的直徑。

1.2.5 抑菌劑對植物乳桿菌C88生長的影響

選用乳制品生產(chǎn)中常用的3種抑菌劑：氯化鈉、山梨酸鉀和丙酸鈣。配制含不同濃度抑菌劑的液體MRS培養(yǎng)基，然后將植物乳桿菌C88按體積分?jǐn)?shù)為3%接種量接種到各培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后，于590 nm處測定吸光度，以不添加抑菌劑的液體MRS培養(yǎng)基為空白。植物乳桿菌C88的相對增長率以占空白培養(yǎng)基吸光度的百分比表示。

1.2.6 植物乳桿菌C88抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)

采用最小抑制質(zhì)量濃度值法(MIC)[9]。依據(jù)各類抗生素作用機(jī)制不同，選擇了抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、細(xì)菌核酸合成和蛋白質(zhì)合成以及抑制細(xì)胞質(zhì)膜的10種常用抗生素。上述10種抗菌藥物根據(jù)不同劑型和不同的溶劑進(jìn)行倍比稀釋，終質(zhì)量濃度為512，256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5 mg/L。MRS液體培養(yǎng)基添加不同濃度的抗生素，37℃厭氧培養(yǎng)24 h。根據(jù)生長狀況觀察得出菌株對每種抗生素的MIC值。根據(jù)測定的MIC值和MIC臨界點(diǎn)值EUC(EU Commission)的統(tǒng)計(jì)參考值，確定菌株對各種抗生素的敏感性結(jié)果。鼠李糖乳桿菌LGG作為對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程酸度和蛋白水解活性變化情況

植物乳桿菌C88在37℃發(fā)酵過程酸度及蛋白水解活性變化如圖1所示。由圖1可以看出，在發(fā)酵過程中菌株發(fā)酵乳樣品的滴定酸度逐漸升高。24 h發(fā)酵結(jié)束，植物乳桿菌C88發(fā)酵乳具有較高的滴定酸度（77.4°T）。

植物乳桿菌C88對乳蛋白水解活性與對照組LGG相似。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，植物乳桿菌C88的水解能力在3～9 h有急速下降的過程，12～24 h之間逐漸增長，在第24 h達(dá)到最高，此時(shí)，對應(yīng)游離氨基酸質(zhì)量濃度為210.044 mg/L，與對照組LGG在24 h對應(yīng)的游離氨基酸質(zhì)量濃度（227.176 mg/L）相比差異不顯著(P＞0.05)。據(jù)Georgieva等[10]報(bào)道，分離自保加利亞奶酪中的8株植物乳桿菌水解乳蛋白后形成的游離氨基酸濃度為0.170～0.609 mmol/L的Gly L-1。呂加平等[11]測得保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌水解乳蛋白后游離氨基酸質(zhì)量濃度為61.0～144.6 mg/L和2.4～14.8 mg/L。本研究植物乳桿菌C88具有較高的蛋白水解活性。

2.2 發(fā)酵冷藏期間酸度變化和存活能力

圖2為植物乳桿菌C88(對照LGG)發(fā)酵乳樣品在4℃冷藏期間酸度及菌數(shù)變化曲線。如圖2所示，冷藏28 d期間，植物乳桿菌C88發(fā)酵乳滴定酸度持續(xù)上升（28 d后滴定酸度為90.9°T）。說明植物乳桿菌C88冷藏期間仍繼續(xù)生長，活菌數(shù)繼續(xù)增加，而益生菌LGG生長緩慢。

植物乳桿菌C88初始菌數(shù)為7.61 mL-1（對數(shù)值），發(fā)酵24 h后，活菌數(shù)達(dá)到9.12 mL-1（對數(shù)值）。4℃冷藏期間，2株菌株的活菌數(shù)隨著天數(shù)的增加而逐漸減少，在第28 d時(shí)，活菌數(shù)分別為8.42和8.21 mL-1（對數(shù)值），與24 h發(fā)酵結(jié)束后的活菌數(shù)相比差異不顯著(P＜0.05)。這表明2株菌株在冷藏期間的存活能力均較好，其中植物乳桿菌C88制備發(fā)酵乳樣品中活菌數(shù)最于LGG。

隨著益生菌概念的深入推廣,針對如何提高發(fā)酵乳制品在貨架期內(nèi)益生菌的活菌數(shù)，已成為目前重要的研究課題。雖然目前對益生菌在貨架期末活菌數(shù)量還沒有標(biāo)準(zhǔn)，但是一般認(rèn)為益生菌的活菌數(shù)至少在6 mL-1（對數(shù)值）以上，才能發(fā)揮其益生作用[12]。本研究的植物乳桿菌C88符合這一要求。

2.3 植物乳桿菌C88的凝乳活性

乳酸菌發(fā)酵時(shí)能利用牛乳中的乳糖，產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致牛乳的pH逐漸降低，達(dá)到酪蛋白的等電點(diǎn)時(shí)，酪蛋白聚集沉降，從而形成半固體狀態(tài)的凝膠物質(zhì)，即凝乳現(xiàn)象。一般把在16 h之內(nèi)能凝乳的乳酸菌定義為快速凝乳菌株。

本試驗(yàn)對植物乳桿菌C88在脫脂乳以及補(bǔ)充氮源或碳源的脫脂乳中的凝乳特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，植物乳桿菌C88只有在添加了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%酵母粉的脫脂乳中16 h產(chǎn)生了凝乳，可見植物乳桿菌C88不屬于快速凝乳菌。Nieto-Arribas等[13]對10株從Manchego奶酪中分離得到的植物乳桿菌進(jìn)行了凝乳活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分植物乳桿菌的凝乳活性較差。此外，Medina等[14]的研究也驗(yàn)證了這一結(jié)論。雖然植物乳桿菌C88的凝乳活性較差，但作為附屬菌，可在益生性方面發(fā)揮其獨(dú)特的優(yōu)勢。

2.4 植物乳桿菌C88的抑菌活性

表1為植物乳桿菌C88抑菌活性實(shí)驗(yàn)。由表1可以看出，植物乳桿菌C88對4株致病菌表現(xiàn)出了不同程度的抑制作用，對金黃色葡萄菌的抑制作用強(qiáng)，對大腸桿菌和沙門氏菌的抑制作用良好，對福氏志賀氏菌的抑制作用較弱。但是調(diào)發(fā)酵液pH值為6.5時(shí)，植物乳桿菌C88對4株致病菌均無抑制作用。

表1 植物乳桿菌C88抑菌活性實(shí)驗(yàn)

乳酸菌的抑菌活性取決于很多因素，主要有發(fā)酵乳制品pH的降低，乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸、過氧化氫以及細(xì)菌素等[15]。本試驗(yàn)通過對植物乳桿菌C88的抑菌活性分析表明其抑菌作用主要是其在生長過程中產(chǎn)酸引起的。Essid等[16]研究證實(shí)分離自傳統(tǒng)香腸的17株植物乳桿菌對金黃色葡萄菌和大腸桿菌的抑制作用較強(qiáng)。Schiliager等[17]研究表明分離自牛奶產(chǎn)品的乳桿菌對致病菌的抑制作用主要是因?yàn)楫a(chǎn)酸引起的。與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相類似。

2.5 抑菌劑對植物乳桿菌C88生長的影響

從表2可以看出，3種抑菌劑對植物乳桿菌C88的生長均有不同程度的影響。丙酸鈣對植物乳桿菌C88的生長無顯著影響。當(dāng)氯化鈉質(zhì)量濃度在30 g/L和60 g/L，山梨酸鉀質(zhì)量濃度在1 g/L和2 g/L時(shí)，其對植物乳桿菌C88的生長無顯著影響，并表現(xiàn)出很好的適應(yīng)性，相對增長率在80%～100%之間。而當(dāng)氯化鈉質(zhì)量濃度在80 g/L以上，山梨酸鉀質(zhì)量濃度在5 g/L以上時(shí)，植物乳桿菌C88的生長受到抑制，相對增長率在24%～75%之間。

抑菌劑能有效抑制食品中有害微生物的生長，同時(shí)也會影響食品中發(fā)酵菌株或其他益生菌的生長。高質(zhì)量濃度氯化鈉能影響干酪中發(fā)酵劑菌株和有害微生物的生長[18]。山梨酸鉀和丙酸鈣能有效地抑制食品中酵母菌、霉菌及細(xì)菌的生長，被廣泛應(yīng)用到干酪生產(chǎn)。通常在新鮮干酪生產(chǎn)中，山梨酸鉀的添加量為0.05%～0.1%。本研究中，植物乳桿菌C88只對高濃度的氯化鈉和山梨酸鉀敏感。因此，應(yīng)用于干酪生產(chǎn)中的抑菌劑濃度，不會影響菌株的生長。

表2 抑菌劑對植物乳桿菌C88生長的影響實(shí)驗(yàn)

2.6 植物乳桿菌C88對不同抗生素的敏感性

按照1.2.6中所述方法對供試菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn),根據(jù)E-Test結(jié)果判讀手冊讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表3。

植物乳桿菌C88對卡那霉素、萬古霉素、多粘菌素B、赤霉素等4種抗生素均表現(xiàn)出強(qiáng)耐藥性，最小抑制質(zhì)量濃度均高于512 mg/L；對紅霉素、利福平、氯霉素、青霉素等4種抗生素敏感，與對照菌LGG相類似。益生菌對人體健康影響的一個(gè)非常重要的方面是其耐藥性,其中隸屬于糖肽類的萬古霉素尤其受到關(guān)注。許多乳桿菌,如羅伊氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌均具有對萬古霉素的耐藥性,且被認(rèn)為是一種天然特性[19]。Swenson等[20]研究證實(shí)加氏乳桿菌對糖肽類抗生素具有耐藥性，Kattla等[21]研究證實(shí)乳桿菌對四環(huán)素和氯霉素敏感。本實(shí)驗(yàn)也得出了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表3 植物乳桿菌C88對不同抗生素的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)mg/L

3 結(jié)論

（1）對益生性植物乳桿菌C88發(fā)酵特性的研究。結(jié)果表明，該菌株凝乳活性較低，與益生菌LGG相比較蛋白水解活性較高。將該菌株添加到發(fā)酵乳中，4℃冷藏28d，表現(xiàn)出了很好的存活能力，冷藏結(jié)束時(shí)活菌數(shù)仍保持在8 mL-1（對數(shù)值）以上，并能夠經(jīng)受住乳制品生產(chǎn)中常用抑菌劑的影響。此外，該菌株應(yīng)用于發(fā)酵乳中不會產(chǎn)生后酸化現(xiàn)象。

（2）該菌株對致病菌有較好的抑制作用，抑菌原因主要是因其產(chǎn)酸引起的。在藥物敏感性試驗(yàn)中對各抗生素也表現(xiàn)出一定耐藥性。

（3）在以前的究表明該菌株具有良好的耐酸性及膽鹽耐受性，對免疫系統(tǒng)具有顯著的調(diào)節(jié)功能[22]；經(jīng)體外、體內(nèi)試驗(yàn)表明，該菌株具有較好的抗氧化及降膽固醇功效（未發(fā)表）。但其在酸奶中應(yīng)用及功效還未研究。本研究結(jié)果為植物乳桿菌C88應(yīng)用于功能性乳制品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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Fermentation properties of Lactobacillus plantarum C88

YU Zhi-hui1，2,HOU Ju-min1,LI Da3,WANG Xin1，YANG Zhen-nai1，3
(1.College of Biological and Agricultural Engineering,Jilin University,Changchun 130022，China;
2.Jilin Agriculture Science and Technology College,Jilin 132101，China;
3.Center of Agro-Food Technology,Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130033，China)

The fermentation properties ofL.plantarumC88 was assayed and compared with one selected commercial probiotic strain:L.rhamnosusGG.The results showed that:The strain C88 displayed weak milk-coagulating activity,but strong proteolytic activity;The strain maintained high viability in fermented milk during storage compared withL.rhamnosusGG.Strain C88 also showed a strong antimicrobial activity againstStaphylococcus aureus;Among all the microbe inhibitory agents tested,only calcium propionate did not significantly affect the growth of the strain;Antibiotic sensitivity showed found that the strain was resistant to multiple antibiotics;L.plantarumC88 showed good potential for application in functional foods and health-related products.

probiotic；Lactobacillus plantarum；fermentation properties

Q935

A

1001-2230（2012）03-0024-04

2011-11-23

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（CARS -37）。

于志會（1979-），女，講師，主要從事生物資源保護(hù)與利用研究。

楊貞耐