牛凝乳酶原基因在大腸桿菌中的高效表達及活性檢測

張俊瑞，馬夏吟，張紅星，郝彥玲

（1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.北京農學院食品科學學院，北京 102206）

牛凝乳酶原基因在大腸桿菌中的高效表達及活性檢測

張俊瑞1，馬夏吟1，張紅星2，郝彥玲1

（1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.北京農學院食品科學學院，北京 102206）

以實驗室保存的攜帶凝乳酶原前體基因的重組載體pMD 19-T/bPPC為模板克隆凝乳酶原基因，經雙酶切后與載體pET-30a連接得到重組載體pET-30a/bPC，轉化大腸桿菌BL21（DE3），經IPTG誘導后，采用SDS-PAGE檢測目的蛋白表達情況。重組蛋白經變性/復性、DEAE-Sepharose Fast Flow純化和自催化后檢測凝乳活性。結果表明，重組凝乳酶原基因在大腸桿菌中高效表達，表達量占菌體總蛋白的68%，采用Arima K方法檢測，其凝乳活力達到80 SU/mL。因此，通過大腸桿菌表達系統(tǒng)大量制備具有生物活性的重組牛凝乳酶原的策略是可行的，研究結果為彌補國內天然牛凝乳酶的短缺提供一種途徑。

牛凝乳酶原；高效表達；大腸桿菌BL21（DE3）；凝乳活性

0 引言

小牛凝乳酶是從未斷奶的小牛皺胃中提取的一種可以專一性裂解κ-酪蛋白中Phe105-Met106肽鍵的酸性天冬氨酸蛋白酶，是干酪生產過程中不可缺少的酶制劑[1-4]。然而隨著全球性小牛資源的短缺，牛凝乳酶來源的不足成為干酪行業(yè)發(fā)展的瓶頸。

至今，F(xiàn)DA（美國食品和藥物管理局）已批準了3種凝乳酶生物工程產品可用于干酪生產，即Gist Brocades公司（荷蘭）的乳酸克魯維酵母菌凝乳酶，Genencor公司（美國）的黑曲霉菌凝乳酶和Pfizer公司（美國）的大腸桿菌K-12凝乳酶。而我國對基因工程凝乳酶的研究卻一直處于探索階段，始終未能實現(xiàn)商業(yè)化生產，導致我國凝乳酶主要依賴于進口，嚴重制約我國干酪產業(yè)的發(fā)展[7-8]。本研究結果旨在為構建具有自主知識產權的工程菌株生產凝乳酶提供有效途徑。

1 實驗

1.1 材料

質粒和菌株：攜帶牛凝乳酶原前體基因的重組載體pMD 19-T/bPPC由本實驗室保存；表達載體pET-30a；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）。

試劑及儀器：限制性內切酶，Ex Taq DNA聚合酶及T4 DNA連接酶購自TaKaRa，DEAE Sepharose Fast Flow，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組表達載體pET-30a/bPC的構建

以含有牛凝乳酶原前體基因的pMD 19-T/bPPC為模板，根據(jù)GenBank上已發(fā)表的牛凝乳酶原基因序列（Accession NM_180994）設計引物：

利用PCR技術擴增目的基因bPC，經NdeⅠ和NotⅠ雙酶切后與載體pET-30a(+)連接，并轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒，經酶切鑒定及測序后，重組子命名為pET-30 a/bPC。

1.2.2 重組牛凝乳酶原的誘導表達

重組載體pET-30a/bPC轉化表達菌BL21（DE3）后，以1%的比例接種于LB/Kan液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600達0.4-0.6，加入IPTG（終濃度為1 mmol/L）誘導培養(yǎng)4 h，收集菌體，超聲破碎，利用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達情況。

1.2.3 包涵體的變性/復性

重組牛凝乳酶原在大腸桿菌中以包涵體的形式積累，經收集后溶于含有8 M尿素的Buffer A（濃度為50 mmol/L的KH2PO4，1 mmol/L的EDTA，50 mmol/L的NaCl，pH值為11.0）進行變性，取上清25倍稀釋于含有GSH/GSSG的Buffer A中，室溫放置24 h后，用HCl將pH值調至8.0，并于室溫下放置1 h，于緩沖液（濃度為20 mmol/L的Tris-Cl（pH=8.0），50 mmol/L的NaCl，1 mmol/L的EDTA）中進行4℃過夜透析，即得到復性后的凝乳酶原[9]。

1.2.4 重組牛凝乳酶原的純化及活性檢測

利用DEAE Sepharose Fast Flow純化復性后的凝乳酶原，經平衡緩沖液（20 mmol/L的Tris-Cl（pH=8.0），1 mmol/L的EDTA，50 mmol/L的NaCl）平衡填料，透析后的凝乳酶原經0.45 μm濾膜過濾后，以2 mL/min的流速上樣。用不同濃度NaCl的Tris-HCl緩沖液線性洗脫目的蛋白，NaCl濃度范圍為0.1～0.5 mol/L，流速為2 mL/min。在線監(jiān)測280 nm的吸收值，收集到的洗脫液經酸化/中和后，采用Arima K的方法檢測凝乳活性[10]。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體pET-30a/bPC的構建

對重組子進行NdeⅠ和NotⅠ的雙酶切鑒定，由圖1可以看出，獲得的兩個片段與預期大小5.4 kbp和1.1 kbp相一致，經上海生工生物技術有限公司測序，其結果與GenBank上發(fā)表的序列（Accession NM_180994）同源性達100%。表明重組表達載體pET-30a/bPC構建成功。

2.2 重組牛凝乳酶原的誘導表達

經SDS-PAGE檢測，重組牛凝乳酶原主要存在于菌體裂解液的沉淀中，表明目的蛋白以包涵體的形式積累。由圖2可知，其分子量約41 ku，與理論值相符。經凝膠定量軟件Quality One分析，重組牛凝乳酶原占菌體總蛋白量的68%。

圖1中，M為DL15000；1為質粒pET-30a(+)雙酶切/NdeⅠ+ NotⅠ；2為重組質粒pET-30a/bPC雙酶切/NdeⅠ+NotⅠ；3為目的基因bPC。

圖2中，M為低分子量蛋白Marker；1為含有空載質粒pET-30a的菌體裂解液上清；2為含有重組質粒pET-30a/bPC的菌體裂解液上清；3為含有空載質粒pET-30a的菌體裂解液沉淀；4為含有重組質粒pET-30a/bPC的菌體裂解液沉淀。

2.3 包涵體的復性及純化

包涵體在高濃度變性劑及強堿性條件下呈變性可溶狀態(tài)，經25倍稀釋去除變性劑后，在GSH/GSSG的輔助下逐漸折疊復性，再經透析即得到復性后可溶的凝乳酶原。采用DEAE-Sepharose Fast Flow純化凝乳酶原，在0.3 M NaCl濃度時有最大吸收峰，收集濃縮后，采用SDS-PAGE檢測結合Quality One軟件分析，其純度達到99%（見圖3）。

圖3中M為低分子量蛋白標準；1為誘導后菌體裂解沉淀；2為離子交換層析純化后的凝乳酶原溶液。

2.4 重組牛凝乳酶原的活化及凝乳酶的活性檢測

純化后的凝乳酶原經酸化/中和后，采用Arima K方法進行檢測。從圖4可知：當脫脂乳中加入重組牛凝乳酶，脫脂乳迅速凝乳，而添加不含重組牛凝乳酶的緩沖液做對照時，脂乳未出現(xiàn)凝乳現(xiàn)象。實驗結果表明：重組牛凝乳酶具有生物活性，其活性可達80 SU/mL。

圖4中，1為以加入不含重組牛凝乳酶的緩沖液為陰性對照組；2為加入重組牛凝乳酶溶液后的效果。

3 結果與討論

本研究中，重組牛凝乳酶原在大腸桿菌中以包涵體的形式積累，占菌體總蛋白的68%，而經變性/復性、純化及自催化后，獲得的具有凝乳活性的重組凝乳酶僅21%。在整個過程中，我們發(fā)現(xiàn)自催化時，當pH值回調至6.3后出現(xiàn)大量沉淀是造成活性重組凝乳酶得率低的主要原因。分析可能上由于在體外復性過程中僅部分凝乳酶原能完成正確折疊進而實現(xiàn)自催化。而未正確折疊的重組蛋白，則在酸化/中和的過程中以沉淀形式析出，實驗結果與1983年J.S.Emtage等人的報道相一致。

為提高包涵體的復性率，2002年，Huge G.Menzella等人在控制蛋白質量濃度為0.8 g/L的條件下，采用空氣氧化（Air Oxidation）的方法可以使48%的變性蛋白正確折疊[11]。而為了得到可溶性凝乳酶原，中國中科院微生物所的楊開宇等人經研究表明，PRPA（protein disulfide isomerase-related protein A）與凝乳酶原在大腸桿菌中的共表達，可以使部分凝乳酶原以可溶形式表達[12]。而M.M.Harmsen等人將BiP（Binding Protein,在酵母中是一種由KAR2基因編碼的約78 ku的多肽分子，存在于內質網(wǎng)腔中，與蛋白的轉運和折疊有關）與牛凝乳酶原在釀酒酵母中共表達，可以使凝乳酶原的胞外表達量提高20倍左右[13]。因而通過各種方法提高包涵體的復性率或者使目的蛋白以可溶形式表達將是今后繼續(xù)努力的方向。

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High-efficiency expression and activity analysis of bovine prochymosin in Escherichia coli

ZHANG Jun-rui1,MA Xia-yin1,ZHANG Hong-xing2,HAO Yan-ling1
(1.College of Food Science&Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China；2.College of Food Science,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

The bovine prochymosin gene was cloned from the recombinant vector of pMD 19-T/bPPC harboring the interest gene,and which was then ligated with the expression vector pET-30a.Ligated products were transformed intoE.coliBL21(DE3).Recombinant protein was analysed by SDS-PAGE after the IPTG induction.The recombinant bovine chymosin was then used to assay the milk-clotting activity after denaturation/renaturation,DEAE-Sepharose Fast Flow purification and activation.The recombinant prochymosin was high-efficiently expressed inE.coli,making up 68%of the total protein.The milk-clotting activity of recombinant chymosin was 80 SU/mL using the Arima K method.So it is possible to largely produce bioactive recombinant bovine prochymosin through theE.coliexpression system.These results would provide a method to solve the problem of lack of authentic bovine chymosin.

bovine prochymosin；high-efficiency expression；E.coliBL21(DE3)；milk-clotting activity

Q93-33

A

1001-2230（2012）03-0004-03

2011-11-07

張俊瑞（1987-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物分子生物學。

郝彥玲