EPO對大鼠腦缺血-再灌注后炎癥損傷的保護作用

寧顯忠，趙德福

(遼寧醫學院附屬第三醫院神經內科,遼寧錦州 121000)

近年來，促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)的神經保護作用得到越來越多的學者的認可，但對EPO發揮神經保護功能的具體機制和途徑目前尚知之甚少。眾所周知，以白細胞侵入為主要標志的炎癥反應是造成腦缺血-再灌注損傷的特征性改變。其中炎癥細胞因子誘發的黏附分子表達上調和由后者介導的白細胞與內皮細胞的相互作用，是炎癥反應的關鍵因素[1]。黏附分子當中比較重要的是細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecules1,ICAM-1)及血管細胞間黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule1,VCAM-1)的。腦缺血后多種炎性細胞因子誘導腦微血管內皮細胞表達ICAM-1和VCAM-1，二者通過與白細胞上的相應受體結合，導致白細胞與內皮細胞黏附、游出，進而浸潤到血管外腦實質，造成腦損傷。本研究通過驗證EPO對誘發炎癥反應的ICAM-1和VCAM-1是否發揮抑制作用為切入點，著重探討EPO對腦缺血-再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠216只，體質量250～300 g，由遼寧醫學院動物中心提供。

1.2藥品與試劑 注射用重組人EPO(批號A20101001)為成都地奧九泓制藥廠產品，ICAM-1、VCAM-1抗體(貨號分別為sc-1511和sc-8304)為美國Santa Cruz公司產品。

1.3方法

1.3.1分組與給藥 將實驗大鼠隨機分為以下3組：(1)EPO干預組72只，缺血2 h后EPO腹腔注射，參照文獻[2]選擇EPO的有效劑量為3 000 U/kg，用生理鹽水溶解，濃度為200 U/mL，給藥后分別于再灌注3、6、12、24、48和72 h后取海馬組織；(2)模型組72只，按模型標準制成大鼠腦缺血-再灌注模型，分別于缺血2 h后腹腔注射等量生理鹽水，于再灌注3、6、12、24、48和72 h后取海馬組織；(3)假手術組72只，只進行手術操作，不進行缺血-再灌注處理，于假手術2 h后腹腔注射等量生理鹽水，分別于上述各時間點斷頭取海馬組織。每個時間點為一個亞組，每亞組12只大鼠。

表1 各組大鼠不同時間點VCAM-1蛋白的表達量

△：P<0.05，△△：P<0.01，與假手術組比較；▲▲：P<0.01，與模型組比較。

表2 各組大鼠不同時間點ICAM-1蛋白的表達量

△△：P<0.01，與假手術組比較；▲：P<0.05，▲▲：P<0.01，與模型組比較。

1.3.2模型的制備 采用線栓法制作大鼠大腦中動脈阻塞模型。水合氯醛麻醉(3 mL/kg)大鼠，分離左側頸總動脈，結扎其近心端，然后在頸總動脈上剪一個小口(約為動脈直徑的1/2)，將充滿肝素的動脈插管插入小口，用手術線結扎固定插管后，將長6 cm的漁線插入動脈插管直至大腦中動脈，腦缺血開始后將動脈插管拔出，把漁線和頸總動脈結扎在一起；2 h后拔出魚線，缺血-再灌注開始，以大鼠出現左側霍納氏征、右前肢伸展受限、活動時向右側旋轉為缺血-再灌注模型制備成功標志。模型組和EPO干預組中的6個亞組分別再灌注3、6、12、24、48和72 h，假手術組6個亞組不進行缺血-再灌注處理。

1.4標本制取與檢測方法

1.4.1免疫組化法檢測海馬區ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達 每個亞組取大鼠6只，烏拉坦麻醉(5 mL/kg)，灌流固定腦組織，斷頭取海馬組織，將標本置于4%多聚甲醛液中固定，制成厚度為5 μm的病理切片。取上述切片常規脫蠟，蒸餾水洗滌，3%過氧化氫溶液處理30 min，以去除內源性過氧化物酶，0.01 mol/L PBS洗滌3次(每次5 min);分別滴加適當稀釋的兔抗大鼠ICAM-1一抗或兔抗大鼠VCAM-1-抗，4 ℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS洗滌3次(每次5 min);滴加辣根酶標記羊抗兔多聚體(PV6001)，37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次(每次5 min);二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片，鏡下觀察海馬組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達情況。二者均主要于內皮細胞膜表面表達，呈棕黃色顆粒狀。

1.4.2Western blot分析海馬組織ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達 取每組剩余6只大鼠，麻醉方法同上，取其海馬組織迅速置于―80 ℃冰箱中凍存備用。Western blot 檢測分為以下6步：(1)制備蛋白樣品；(2)測定上清液蛋白含量；(3) 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳；(4)采用正電荷尼龍膜(PVDF)轉移；(5)雜交；(6)顯色分析，用Gene Genius凝膠圖像系統分析各蛋白目的條帶吸光度，用目的條帶與β-actin條帶吸光度的比值表示目的蛋白的含量。

2 結 果

2.1免疫組化染色結果 觀察區域主要選擇在大鼠海馬組織的CA1區，黏附分子的表達部位主要集中在血管內皮細胞表面。結果顯示，假手術組血管內皮細胞表面有極少量VCAM-1和ICAM-1蛋白表達的陽性細胞；與假手術組比較，模型組ICAM-1和VCAM-1蛋白表達的陽性細胞于再灌注6 h開始逐漸增多，再灌注后12～48 h明顯增多，以后有所減少；與模型組各時間點相比較，EPO干預組VCAM-1的表達量從12 h開始減少，24～72 h明顯減少，而ICAM-1從6 h即開始減少，12～72 h明顯減少。

圖1 各組大鼠不同時間點VCAM-1蛋白的

圖2 各組大鼠不同時間點ICAM-1蛋白的

2.2Western blot檢測結果 假手術組有極少量VCAM-1和ICAM-1蛋白的表達。與假手術組比較，模型組再灌注6 h VCAM-1和ICAM-1蛋白可見有少量表達，以后表達量逐漸增多，VCAM-1的表達高峰出現在再灌注24～48 h；而ICAM-1則在再灌注12～48 h一直持續較高，以后表達量逐漸減少。與模型組各時間點相比較，EPO干預組VCAM-1的表達量從12 h開始減少，24～72 h明顯減少，而ICAM-1從6 h即開始減少，12～72 h明顯減少。見表1、2，圖1、2。

3 討 論

近年來，對于EPO的神經保護作用的關注越來越多。但關于EPO對腦缺血-再灌注后炎癥損傷的抑制作用，尤其是對于誘導炎癥反應的關鍵物質黏附分子的抑制作用，國內外鮮有報道。

本實驗通過線栓法制作成年大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型，觀察VCAM-1和ICAM-1蛋白在腦缺血-再灌注損傷中的作用，以及EPO對此過程的抑制作用。研究結果顯示，在大鼠局灶性腦缺血-再灌注6 h，即有VCAM-1和ICAM-1蛋白的少量表達，不論是陽性細胞數還是表達量都較假手術組有所增加，之后表達量逐漸增多，VCAM-1的表達高峰出現在再灌注24～48 h，而ICAM-1的表達則在再灌注12～48 h一直持續較高，以后表達量有所減少。需要指出的是，內皮細胞無論在未被激活還是被激活后表達的ICAM-1均高于VCAM-1，并且ICAM-1在腦損傷后的上調表達要早于VCAM-1，而其下降又稍晚于VCAM-1?？梢奍CAM-1相對于VCAM-1容易表達且較穩定，也說明前者在腦損傷發生中起主要作用。

EPO是由腎臟和胚胎肝臟產生的一種能促進紅細胞生成的細胞因子，主要用于治療多種原因所致的貧血。但近年的研究發現，在許多非造血細胞系如腎、心肌、平滑肌和神經原細胞中也存在EPO及其受體(erythropoietin receptor,EPOR)基因表達[3]。動物實驗和體外細胞培養已證實，EPO對腦缺血具有神經保護作用[4]。本實驗于大鼠缺血后2 h給予EPO腹腔注射，研究結果顯示，與模型組相比較，應用EPO后，EPO干預組VCAM-1和ICAM-1蛋白的陽性細胞數和蛋白表達量均有所下降。而且需要指出的是，ICAM-1于用藥后6 h即開始下降，而 VCAM-1于用藥后12 h才開始下降，表明在誘導炎癥作用時作用相對較大的ICAM-1對EPO的反應也相對較VCAM-1敏感。由此可見，EPO可以通過抑制ICAM-1和VCAM-1蛋白表達的上調(主要是ICAM-1)，實現對腦缺血-再灌注損傷后炎癥損傷的抑制作用。

近幾年來，關于EPO的神經保護作用研究方興未艾，其機制除了抗炎作用以外，目前正在研究中的還有抗谷氨酸興奮毒性[5]、調節一氧化氮(NO)的合成[6]、抗氧化作用、抗神經元凋亡[7-8]、促進血管生成[9]、促進神經元再生和神經營養作用等。其對腦血管的保護作用正逐漸成為臨床和科研的新熱點[10]。尤其是近來的研究發現，腦缺血動物腦內可見EPO和EPOR表達[11]，外源性EPO可通過血腦屏障進入腦內[12]，為EPO的臨床應用墊定了理論基礎。因此，EPO在腦缺血-再灌注損傷的應用方面有廣闊的臨床應用前景。

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