益氣化瘀化痰法對肺纖維化大鼠TGF-β1、PAI-1的影響*

賀 雄，曹文富,趙蘋利,李 艷,黃 欣

(重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科 400016)

肺纖維化是肺組織在受到外界各種刺激后，引起的肺組織炎性損傷，結構破壞，逐漸伴有肺間質細胞增生的組織修復過程。研究表明，大量的細胞因子參與纖維化進程中，其中轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是促進纖維細胞激活向肌成纖維細胞轉化的關鍵因子[1-2]，也是目前最公認的致纖維化細胞因子；纖溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)則主要參與細胞外基質(extracellular matrixc,ECM)的降解過程，PAI-1的增加會導致ECM降解減少，致使ECM的生成與降解失衡，最終導致肺纖維化[3]。目前治療肺纖維化以激素和免疫抑制劑為主，但尚無較理想的藥物，如何通過有效抑制TGF-β1等因子的表達，使ECM的生成減少，或者減少PAI-1等因子的生成而促進ECM降解，最終改善肺組織代謝狀況等新途徑來治療肺纖維化，成為當前該領域研究的重點[4-5]。本研究基于西醫對肺纖維化理論的認識和中醫藥治療肺纖維化的獨特優勢，采用益氣化瘀化痰法探索治療肺纖維化的新途徑，選用黃芪、白術、川芎、姜黃、半夏、海藻共六味中藥，對博來霉素致肺纖維化大鼠進行治療，報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑 SD大鼠105只(雌雄不限)，體質量180～220 g，由重慶醫科大學SPF級實驗動物研究中心提供，動物生產許可證：SCXK(渝)2007-0001，SPF級清潔環境喂養；鹽酸博來霉素由日本化藥株式會社生產(批號：H20090885，規格15 毫克/瓶)；氫化可的松注射液由天津金耀氨基酸有限公司生產(批號：H12020887，規格：20 毫升/支)；大鼠PAI-1 ELISA試劑盒由重慶鼎國生物技術有限公司提供(RD分裝)；TGF-β1蛋白抗體為Santa Cruz公司產品；中藥飲片由重慶桐君閣中藥批發有限責任公司提供；實驗指標的測定在重慶醫科大學眼科學重慶市市級重點實驗室完成。

1.2動物分組與肺纖維化模型建立 采用隨機法將105只大鼠分為7組：正常對照組、模型組、激素組、益氣組、化瘀組、化痰組、益氣化瘀化痰組，每組各15只。適應性喂養2周后，對照組一次性氣管內注射生理鹽水0.1 mL/100 g，其余各組均采用一次性氣管內注射等量鹽酸博來霉素(5 mg/kg)制作大鼠肺纖維化模型[6-7]，于造模后28 d處死模型組3只大鼠，電鏡下觀察纖維化造模是否成功，然后給予中藥及激素干預治療。益氣組由黃芪、白術組成煎劑灌胃，化痰組由半夏、海藻組成煎劑灌胃，化瘀組由川芎、姜黃組成煎劑灌胃，益氣化瘀化痰組由以上所有中藥組成煎劑灌胃，各組煎劑中按照每1 mL含生藥2 g進行熬制，各組灌胃劑量按照30 g·kg-1·d-1進行。激素組給予氫化可的松5 mg·kg-1·d-1進行腹腔注射。模型組及正常對照組每日給予等量生理鹽水灌胃，干預2個月后處死全部大鼠。

1.3標本取材與處理

1.3.1血漿采集 10%水合氯醛按0.3 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉大鼠，常規消毒，備皮，切開胸腔，暴露心臟，將空針直刺入心室取血，置于抗凝管內，搖勻，3 000 r/min離心10 min后取上清液分裝在1.5 mL離心管內，―80 ℃冰箱中保存待檢。

1.3.2肺組織勻漿上清液備制 將采血完后的大鼠立即置于4 ℃冰盒上，將肺組織剪成小塊狀，生理鹽水清洗，稱質量，加入裂解液，蛋白酶抑制劑，超聲打碎，直至組織完全裂解，3 000 r/min離心7 min后取勻漿上清液分裝在1.5 mL離心管內，置于―20 ℃冰箱中保存待檢。

1.4血漿PAI-1和肺組織TGF-β1水平測定

1.4.1血漿PAI-1測定 采用ELISA法，敏感度為1.0 pg/mL，操作按照試劑盒說明書進行。

1.4.2肺組織TGF-β1測定 采用Western blot法，取肺組織勻漿上清液，先用BCA蛋白濃度測定試劑測定每組大鼠肺組織TGF-β1蛋白含量，再按照SDS-PAGE電泳，蛋白質轉膜，膜的封閉，抗體孵育，化學發光，顯影，定影，用凝膠圖像處理系統分析目標蛋白帶的相對分子質量，用Image J軟件計算蛋白凈光密度值。

2 結 果

2.1各組大鼠一般情況比較 與正常對照組比較，模型組大鼠第2天表現為精神極差，毛發疏松聳立，活動及進食均明顯減少；造模后第3天或4天，除了出現上述癥狀外，大鼠雙眼、鼻部、唇部及舌體顏色明顯變烏黑暗淡，表現出嚴重的缺血缺氧狀態，體質量也逐漸減輕。造模28 d后模型組大鼠肺組織結構電鏡照片，見封2圖1。造模過程中約1/6的大鼠會出現腹部脹大，且逐漸加重，直至腹脹如蛙腹，大便稀溏，極度消瘦等癥狀，甚至死亡。經中藥干預治療后，大鼠的精神、毛發、活動等一般情況得到有效改善。益氣化瘀化痰組大鼠肺組織結構電鏡照片，見封2圖2。

2.2各組大鼠血漿PAI-1水平 各組大鼠血漿PAI-1水平見表1。

表1 各組大鼠PAI-1水平

*：P<0.05，與正常對照組比較;Δ：P<0.05，與模型組比較;☆：P<0.05，與益氣組、化痰組、化瘀組比較;◇：P<0.05，與益氣化痰化瘀組比較。

2.3各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達情況 各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達情況見圖3，表2。

注：圖片條帶從左到右依次為化瘀組、模型組、益氣化瘀化痰組、益氣組、激素組、化痰組、正常對照組。

圖4各組大鼠肺組織Western blot電泳照片

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達情況

*：P<0.05，與正常對照組比較;Δ：P<0.05，與模型組比較;☆：P<0.05，與益氣組、化痰組、化瘀組比較。

3 討 論

TGF-β1是一種參與各種生物過程的多功能細胞因子，如胚胎發育，腫瘤的生長和分化，細胞增殖和凋亡，纖維組織的修復和調節免疫反應等[8-9]。TGF-β1表達的上調是肺、肝、腎等纖維化疾病產生的關鍵步驟[10-11]。PAI-1是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員之一，能調節纖溶蛋白水解和抑制纖溶酶原激活。血漿PAI-1水平的升高可作為觀察各種血栓形成的條件，包括心肌梗死、深靜脈血栓和彌散性血管內凝血等[12-13]。肺纖維化、腎小球腎炎等PAI-1基因的表達水平明顯增加，同時研究證明PAI-1還可以使TGF-β1信號明顯增強，進一步導致ECM的積累和增加PAI -1的表達，形成纖維化進程的惡性循環[14-15]。目前爭對上述兩種細胞因子在纖維化進程中的具體作用機制尚未充分認識，因此西醫目前未研究出一種能作用在這兩種細胞因子上的有效藥物。

在已知纖維化形成的相關機理上，采用傳統中醫藥進行研究，有利于中西醫理論更深層次的結合。中醫在肺纖維化的治療中強調益氣、化瘀、化痰，通過補益肺氣，使津液正常運化代謝，從而阻斷痰濁生成；通過化瘀化痰，以消除實邪，達到邪扶正之功效。本研究中選取益氣藥黃芪和白術，其中黃芪為補氣之要藥，尤其針對肺脾氣虛效果顯著，配白術以增強其補氣功效，相關文獻已有報道黃芪能夠延緩甚至抑制纖維化的進程；化瘀藥選取川芎和姜黃，其中川芎為“血中之氣藥”，對氣滯血瘀證作用明顯，文獻報道其主要成分川芎嗪能降低博來霉素誘導的肺纖維化大鼠血清及肺組織TGF-β1的表達[9]，降低肺纖維化的增生程度，并配姜黃以加強行氣活血之功；化痰藥選取半夏和海藻，其中半夏為治療痰證的要藥，健脾化痰以消除生痰之源，配海藻以增強其化痰散結的功效。以上六味中藥配伍能達到祛實邪、補肺氣的作用效果。

相關文獻報道經博來霉素誘導生成的大鼠肺纖維化模型致死率可高達50%，且部分大鼠肺組織在造模后28 d有自限性傾向，在本實驗中造模后大鼠的致死率約為40%，需通過反復造模來保證大鼠纖維化模型的數量，且28 d后未發現自限性傾向。實驗結果表明，益氣化瘀化痰組大鼠血漿PAI-1水平較模型組明顯降低(P<0.05)，且效果優于其他中藥組(P<0.05)；益氣化瘀化痰組大鼠TGF-β1蛋白表達光密度值明顯低于模型組，與正常對照組和激素組數值較為接近。根據本研究結果推測，益氣化瘀化痰可以有效降低血漿PAI-1含量及肺組織TGF-β1的表達，從而在一定程度上抑制了ECM的生成和堆積，增加了組織纖維的降解，達到改善肺組織纖維化的治療效果。本研究結果還可推廣至肝、腎等器官纖維化的治療，但其具體的作用機制還有待于進一步深入研究。

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