聯合偶合概率與似然比率在炭化骨骼個人識別中的計算及分析*

徐國昌，齊 靜，任 甫，劉海東

(1.南陽理工學院生物人類學研究所，河南南陽 473004；2.遼寧醫學院人類學研究所，遼寧錦州 121000；3.山東省濰坊市公安局 261041)

在火災、焚尸、交通、空難、爆炸等案件和事故中常需要對炭化骨骼進行個人識別[1-2]。人體軟組織被燒焦或者缺失時，留下的骨骼殘骸就顯得尤為重要[2-3]。國內外研究者近年來對骨骼法醫學價值進行探討并取得了一定成績，但如何利用分子生物學技術對殘存位點進行計算與分析，仍是困擾該類研究的首要問題[4-8]。為了探討聯合偶合概率(random match probability，RMP)與似然比率(likelihood ratio，LR)在炭化骨骼個人識別中的計算及分析，本研究采用改進的酚-氯仿法提取DNA，應用熒光標記復合擴增系統擴增15個STR和1個性別基因位點并經遺傳分析儀進行電泳檢測，獲得基因位點的基本資料，了解基因位點焚燒后的存留情況，利用存留基因位點圖譜比對，進行個人識別力(discrimination power，DP)和累積識別力(total discrimination power，TDP)、RMP、LR的計算，為炭化骨骼個人識別提供有效的檢測方法和判定依據。

1 材料與方法

1.1樣本采集與處理 新鮮成人尸體，男、女各1具，分別取出一側股骨，清除骨骼表面組織，紫外光照射2 h，鋸取股骨干3塊，隨機取1塊做對照，余2塊分別置于馬弗爐中，常大氣壓下以300 ℃焚燒1 h，標記備用。

1.2主要試劑(盒)、儀器設備和軟件 主要試劑(盒)：相對分子質量內標、二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、飽和酚、正丁醇、異戊醇、液氮；AmpFlSTR ID Kit、PCR reagents、QIAquick?PCR Purification Kit、DNA tapy TM15 Kit、Amp FLSTR Identifiler Kit。主要儀器設備：SX型馬弗爐、生物冷凍研磨器、GeneAmp PCR System9700、3100xl Genetic Analyzer、高速冷凍離心機。主要軟件：Data Colletion(Version 2.0)軟件、Gene Mapper(Version 3.2)軟件、SPSS13.0統計分析軟件。

1.3樣本基因組DNA提取與檢測

1.3.1提取 每一樣本機械粉碎后，液氮下磁性振蕩研磨20 min。分析天平稱取每份樣本2.00 g置于EP管，EDTA脫鈣。加入裂解液，50 ℃水浴16～24 h。冷凍離心后取上液加入飽和酚、三氯甲烷、異戊醇混液，離心，取上層液。加入正丁醇，混勻離心，棄上清液，加入乙醚，混勻離心，棄上清液。

1.3.2純化 有機法聯合QIAquick?PCR Purification Kit。Buffer PB 5 mL，RNA 1 μL，離心后取上層液，硅膜濾過，離心。Buffer PB復洗，PE洗液混勻離心，重復2～3次。加入溴化乙啶(EB)30 μL，52 ℃ 5 min，冷凍離心。

1.3.3PCR復合擴增 按照Amp FlSTR IdentifilerTM試劑盒的說明書，在GeneAmp PCR System 9700進行16個基因位點的復合擴增。反應體系10 μL，反應參數：95 ℃ 11 min，94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，60 ℃ 60 min。共30個循環。

表1 300 ℃焚燒成人股骨存留基因位點的個Pm、DP及TDP

Pm：偶合概率；+：檢出；-：未檢出。

1.3.4檢測 PCR產物 用ABI-3100xl型基因分析儀電泳，電泳信息由軟件Data Colletion V 3.0收集，電泳條件為時間2 h，溫度60 ℃，電壓15 kV，電流140 μA。Gene Mapper Idv 3.2軟件把收集的電泳圖譜信息經計算機處理成數據信息，與等位基因分子內標比對。

圖1 樣本(男)基因位點檢測結果

圖2 樣本(女)基因位點檢測結果

2 結 果

2.1基因位點檢測結果 兩例樣本均成功提取出DNA，男尸樣本DNA圖譜有9個位點讀出，D8S1179、D21S11、D3S1358、TH01、D19S433、vWA、TPOX、D5S818、FGA，見圖1；女尸樣本DNA圖譜有15個位點讀出，D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA，見圖2。與相應未燒骨組織的基因位點相比，位點D2S1338沒有檢出，相對熒光單位(relative fluorescence units，RFU)值在1 000以下。計算基因位點檢出率，男、女例分別為56.25%、93.75%。

2.2個人識別統計分析 按照所述公式計算所檢各樣本Pi、Pm，以法醫DNA分析表作為參照[9]，計算出不同溫度焚燒后DP、TDP，見表1。由表1可見，300℃，TDP(男)：0.999 999 980 3，TDP(女)：>0.999 999 999 999 99。計算RPM和LR值，RPM(男)：2.322 5×10-12，RPM(女)：4.931 3×10-24；LR(男)：4.305 7×1011；LR(女)：2.027 9×1023。

3 討 論

3.1RMP與LR概率及意義[9]偶合概率是指從同一群體中隨機抽取兩名個體的遺傳基因型不相同的概率即遺傳標記識別無關個體的能力，也是遺傳標記對于個人識別效能的定量評估。TDP反映多個遺傳標記的識別能力。所用遺傳標記數目越多，識別概率越高，鑒別能力越強。偶合概率或叫匹配概率，指人群中隨機抽取二無關個體在特定基因座二者的基因型純粹由于機會一致的概率。LR是假設比對樣品個體就是物證DNA的供體的概率與假設人群中隨機個體是物證DNA供體的概率比。利用DNA技術，對現場檢材與比對樣本的基因型比對，計算被檢出基因座在人群中的TDP、RMP和LR，可使識別率達到1×1011以上，盡可能地利用基因位點來判定已成為個人識別的主流發展方向。

3.2溫度對炭化骨骼DNA完整性的影響 骨骼屬于硬組織，相對于人體的其他組織抗焚燒能力強且保存時間長[10]，對各種因素有較高的抵抗性，能夠保護內部DNA結構，減緩DNA降解和污染，因而成為與焚燒有關的案件和事故中物證缺乏情況下的首選檢材。溫度升高，加速了遺傳物質水解反應，DNA解鏈、斷裂；當升至一定溫度，致使模板量嚴重不足，無法提取出DNA而導致檢材無法判定。炭化骨骼微量的DNA的提取，國內外學者一直就沒有停止探索，本研究中采用改良的酚-氯仿法對其進行提取，效果令人滿意[5,10-15]。炭化骨骼DNA位點的檢出率及檢測效果明顯受焚燒程度的影響，焚燒程度越重DNA檢出成功率越低，DNA檢驗圖譜就存在不同程度的位點缺失[4]。本研究表明在300℃大部分位點能夠檢出，表明存留基因位點對溫度升高的耐受力表現相對穩定。在法醫實踐中，因受熱順序和時間差異，不同溫度焚燒所遺骨骼表面顏色不同，就目前技術水平，實踐應用中，據此大致推斷焚燒時的溫度，估計DNA的存留情況，再取舍樣本，可提高檢測的準確性。

3.3個人識別的分析 法醫DNA分析最大的一個領域是對生物物證進行個體識別。在保證受檢樣本結果正確的前提下，如果比對圖譜的分型結果不同，可以排除兩個DNA來自同一個體；如果分型相同則有兩種可能，一是來自同一個體，二是來自不同個體，只是所檢的標記分型一致，此時需要增加DNA標記，當檢驗的RMP在1×10-11以下時，可以認定來自同一個體。進行個人識別和同一認定，最重要的是需對現場檢材與比對樣本的基因型，計算被檢出基因座的TDP、RMP。在沒有近親關系存在、嚴格遵守質量控制、無突變、分型正確的前提下，保守地估算，偶合概率達到地球人口的百倍時，可以作出個體同一的認定。在本研究中，選取的男例樣本RMP為2.322 5×10-12，女例樣本為4.931 3×10-24，均小于1×10-11，和他(她)本人的LR分別達到了4.305 7×1011和2.027 9×1023，完全可以認定為同一個體。由此，提示炭化骨骼作為物證，不要輕易棄之，內部極有可能存留有完全可以作出個人識別的DNA。

綜上所述，采用基因分析儀檢測存留位點，計算TDP、RMP、LR值可以對炭化骨骼進行個人識別，有較高的法醫學實踐應用價值。

[1]徐國昌，任甫，候續偉，等.燒骨組織形態變化及DNA技術在個體識別中的應用[J].法醫學雜志，2007，23(5)：370-372,379.

[2]劉海東，任甫，邢瑞仙，等.燒骨個體識別的研究進展[J].法醫學雜志，2009，25(1)：61-62.

[3]Schuliar Y,Knudsen PJ.Role of forensic pathologists in mass disasters[J].Forensic Sci Med Pathol,2012,8(2)：164-173.

[4]徐國昌，侯續偉，任甫，等.不同溫度焚燒對成人股骨16個基因位點的影響[J].解剖學雜志，2008，31(3)：406-408.

[5]劉海東，李革，任甫，等.燒骨基因位點保存狀況及檢測方法比較[J].解剖學雜志，2009，32(4)：527-529.

[6]Jules A,Kieser,Joy T,et al.Morphoscopic analysis of experimentally produced bony wounds from low-velocity ballistic impact[J].Forensic Sci Med Pat,2011,7(4)：322-332.

[7]Konstantinos M,Chara S.Identification and differential diagnosis of perimortem blunt force trauma in tubular long bones[J].Forensic Sci Med Pat,2006,2(4)：221-229.

[8]Cartiser N,Bévalot F,Fanton L,et al.State-of-the-art of bone marrow analysis in forensic toxicology：a review[J].Int J Legal Med,2011,125(2)：181-198.

[9]鄭秀芬.法醫DNA分析[M].北京：中國人民公安大學出版社，2002：45-408.

[10]葉健，季安全，趙興春，等.燒骨DNA檢驗技術的研究[J].法醫學雜志，2004，20(3)：155-159.

[11]徐國昌，侯續偉，任甫，等.燒骨DNA提取與檢測技術的實驗研究[J].中國臨床解剖學雜志，2012，30(1)：91-95.

[12]Thompson TJ.Heat-induced dimensional changes in bone and their consequences for forensic anthropology[J].J Forensic Sci,2005,50(5)：1008-1015.

[13]Steadman DW,Diantonio LL,Wilson JJ,et al.The effects of chemical and heat maceration techniques on the recovery of nuclear and mitochondrial DNA from bone[J].J Forensic Sci,2006,51(1)：11-17.

[14]Hartman D,Drummer O,Eckhoff C,et al.The contribution of DNA to the disaster victim identification(DVI) effort[J].Forensic Sci Int,2011,205(1-3)：52-58.

[15]Ubelaker DH.The forensic evaluation of burned skeletal remains：a synthesis[J].Forensic Sci Int,2009,183(1-3)：1-5.