高產(chǎn)β-半乳糖苷酶植物乳桿菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)研究

谷月華，張京聲，安浩然，郝彥玲

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

高產(chǎn)β-半乳糖苷酶植物乳桿菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)研究

谷月華，張京聲，安浩然，郝彥玲

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

β-半乳糖苷酶不僅能通過分解乳制品中乳糖解決乳糖不耐癥問題，同時(shí)能通過轉(zhuǎn)糖苷作用合成具有益生功能的低聚半乳糖。從8株植物乳桿菌中篩選出高產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株K2，比活力高達(dá)6620 U/g，并對(duì)β-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：β-半乳糖苷酶最適和最穩(wěn)定的pH值為6.5，最適溫度為60℃，而在40℃穩(wěn)定性最強(qiáng)。Mg2+對(duì)β-半乳糖苷酶活力有明顯促進(jìn)作用，而Cu2+有強(qiáng)烈抑制作用，通過推導(dǎo)求得米氏常數(shù)Km,oNPG=1.15 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax,oNP=6.34 μmol/（min·mg）。研究結(jié)果為具有解決乳糖不耐受癥的植物乳桿菌微生態(tài)制劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

β-半乳糖苷酶；植物乳桿菌；酶學(xué)性質(zhì)

0 引 言

原發(fā)性乳糖酶缺乏導(dǎo)致的乳糖不耐癥是目前影響最大的營養(yǎng)代謝障礙之一，我國88.9%的成年人有乳糖酶缺乏，55.1%的成年人有乳糖不耐癥狀[1-2]。乳糖不耐癥的主要解決方法是利用β-半乳糖苷酶分解乳制品中乳糖[3]。β-半乳糖苷酶還能轉(zhuǎn)糖苷合成有益生功能的低聚半乳糖（GOS）[4-5]。

植物乳桿菌是人體胃腸道益生菌，具有維持腸道菌群平衡和提高機(jī)體免疫力等功能[6-7]。Rhee等對(duì)從泡菜中篩選出的植物乳桿菌β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行了研究[8]；Iqbal等將植物乳桿菌的β-半乳糖苷酶基因作同源過表達(dá)并研究其酶學(xué)性質(zhì)及轉(zhuǎn)糖苷作用[9]；而國內(nèi)還未有相似報(bào)道。本文篩選到一株分離自新疆酸馬奶中高產(chǎn)β-半乳糖苷酶的植物乳桿菌并系統(tǒng)研究其酶學(xué)性質(zhì)，研究結(jié)果為解決乳糖不耐癥的植物乳桿菌微生態(tài)制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

（1）菌株來源：植物乳桿菌F1分離自臘腸，植物乳桿菌LB-B1、G4和K2分離自新疆酸馬奶，植物乳桿菌7-4-3、07-191和WQ0815分離自四川泡菜，植物乳桿菌05-19分離自保健品。

（2）培養(yǎng)基與試劑：高產(chǎn)β-半乳糖苷酶植物乳桿菌篩選培養(yǎng)基為改良MMRS液體培養(yǎng)基（MMRS培養(yǎng)基中用乳糖替代葡糖糖作為碳源）。

1.2 方法

1.2.1 高產(chǎn)β-半乳糖苷酶植物乳桿菌的篩選

（1）植物乳桿菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶粗酶液制備。將8株植物乳桿菌按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種于改良MMRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)好的菌液5 000 r/min離心10 min后棄上清，沉淀經(jīng)預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌后，在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，裂解后的菌液于4℃12 000 r/min離心10 min，收集粗酶液。

（2）β-半乳糖苷酶活力測(cè)定。取0.1 mL粗酶液與0.9 mL濃度為0.01 mol/L鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）的0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH值為6.5）混勻37℃反應(yīng)10 min后，加入1.5 mL濃度為0.4 mol/L的Na2CO3終止液靜置5 min，于420 nm比色測(cè)定生成鄰硝基苯酚（ONP）濃度。1個(gè)酶活性單位（U）定義為在37℃下每分鐘分解出1 μmol ONP所需的酶量。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Bradford法測(cè)定粗酶液中總蛋白量。將酶活性換算為比酶活，以U/g蛋白表示。

1.2.2 β-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)

（1）pH值對(duì)β-半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響。測(cè)定β-半乳糖苷酶粗酶液在不同pH值的濃度為0.05 mol/L緩沖液中酶活力，確定pH值對(duì)β-半乳糖苷酶活力的影響。緩沖液分別為醋酸鈉（pH值為4.5，5.0和5.5）、磷酸鈉（pH值為6.0，6.5，7.0和7.5）和Tris-HCl（pH值為8.0，8.5和9.0），相對(duì)酶活用百分比來表示。將β-半乳糖苷酶在上述緩沖液中37℃保溫2 h和24 h后，測(cè)殘留的酶活力，分析pH值對(duì)β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響。

（2）溫度對(duì)β-半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響。測(cè)定β-半乳糖苷酶粗酶液在不同溫度 （溫度范圍為25～75℃）時(shí)的酶活力，確定溫度對(duì)β-半乳糖苷酶活力的影響。將β-半乳糖苷酶與濃度為0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH值為6.5）混勻后，分別在30，40，50，和60℃保溫4 h，每隔1 h測(cè)一次殘留的酶活，分析溫度對(duì)β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響。

（3）不同金屬離子及離子濃度對(duì)β-半乳糖苷酶的影響。將β-半乳糖苷酶與濃度為0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH值為6.5）混勻，并添加各種不同的金屬離子（K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Cae、Zn2+和Fe3+） 至終濃度分別為1，10和100 mmol/L，于37℃測(cè)定酶活。

（4）β-半乳糖苷酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定。由雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver–Burk plots）測(cè)定β-半乳糖苷酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax）[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)β-半乳糖苷酶植物乳桿菌的篩選

對(duì)8株植物乳桿菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶比活力的測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，植物乳桿菌7-4-3的乳糖酶活力最低，僅為1283 U/g，而植物乳桿菌K2比活力最高，達(dá)到6620 U/g。因此植物乳桿菌K2作為后續(xù)研究對(duì)象。

2.2 pH值對(duì)β-半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響

pH值對(duì)酶催化反應(yīng)的影響分別為影響酶催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物效率以及酶的穩(wěn)定性。在pH值為4.5～9.0范圍內(nèi)測(cè)定β-半乳糖苷酶的活性，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，β-半乳糖苷酶的最適pH值為6.5。當(dāng)pH值為6.5時(shí)，β-半乳糖苷酶37℃保溫24 h后仍有80%的活力。因此β-半乳糖苷的最適酶活力和穩(wěn)定性皆是pH值為6.5。

2.3 溫度對(duì)β-半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響

測(cè)定在不同溫度時(shí)β-半乳糖苷酶粗酶液的酶活力，確定溫度對(duì)β-半乳糖苷酶活力的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，60℃時(shí)，β-半乳糖苷酶活力最高。隨著溫度升高，β-半乳糖苷酶活力急速下降，75℃時(shí)僅殘留19%。由圖4可以看出，在30℃和40℃時(shí)，保溫處理4 h后仍有85%酶活力，而在最適溫度60℃時(shí)，僅處理30 min后基本失去活性。人體內(nèi)的溫度為37℃，pH值為近中性，因此，作為益生菌的植物乳桿菌K2所產(chǎn)β-半乳糖苷酶在人體內(nèi)具有解決乳糖不耐癥的前景。

2.4 不同金屬離子及離子濃度對(duì)β-半乳糖苷酶的影響

不同金屬離子及離子濃度對(duì)β-半乳糖苷酶的影響結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，在各種金屬離子中，K+、Na+、Mg2+和Mn2+在適當(dāng)濃度范圍內(nèi)對(duì)β-半乳糖苷酶酶活有促進(jìn)作用，但隨著濃度增加，促進(jìn)作用減弱或變成抑制，其中Mg2+對(duì)β-半乳糖苷酶活力的促進(jìn)效果最明顯，當(dāng)添加濃度為10 mmol/L的Mg2+時(shí)，酶活力達(dá)到112.24%。Fe3+、Fe2+、Ca2+、Zn2+和Cu2+對(duì)β-半乳糖苷酶酶活有抑制作用，且隨濃度增加抑制作用加強(qiáng)，其中Cu2+的抑制作用最強(qiáng)，在反應(yīng)液中加入濃度為1 mmol/L后β-半乳糖苷酶即失去活力。

表1 金屬離子對(duì)植物乳桿菌K2的β-半乳糖苷酶活性的影響

2.5 β-半乳糖苷酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

由雙倒數(shù)作圖法可得β-半乳糖苷酶在pH值為6.5，37℃時(shí)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。如圖5所示，通過推導(dǎo)可求得米氏常數(shù)Km,oNPG=1.15 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax,oNP=6.34 μmol/（min·mg）。

3 結(jié) 論

由于乳糖酶缺乏導(dǎo)致乳糖不耐受癥是目前影響最大的全球性營養(yǎng)代謝障礙之一，因此開發(fā)高產(chǎn)β-半乳糖苷酶的益生菌具有重要的應(yīng)用前景。本文從8株植物乳桿菌中篩選出乳糖酶活力高達(dá)6620 U/g的植物乳桿菌K2，并對(duì)其產(chǎn)β-半乳糖苷酶性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明：植物乳桿菌K2的β-半乳糖苷酶的最適pH為6.5，且此時(shí)酶蛋白也最穩(wěn)定；盡管最適作用溫度為60℃，但此溫度下酶蛋白很容易失活，而在30℃和40℃時(shí)酶蛋白十分穩(wěn)定；金屬離子對(duì)β-半乳糖苷酶的酶活有促進(jìn)或抑制作用，其中Mg2+對(duì)β-半乳糖苷酶活力的促進(jìn)效果最明顯，Cu2+則有強(qiáng)烈抑制作用；β-半乳糖苷酶米氏常數(shù)Km,oNPG=1.15 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax,oNP=6.34 μmol/（min·mg）。研究結(jié)果為解決乳糖不耐受癥的植物乳桿菌微生態(tài)制劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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Screening of β-galactosidase highly producing Lactobacillus plantarum and its enzymatic properties

GU Yue-hua,ZHANG Jing-sheng,AN Hao-ran,HAO Yan-ling
（College of Food Science&Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing,100083,China）

β-galactosidase can not only be used to solve the problem of lactose intolerance through hydrolysis of lactose in dairy products,but also to synthesize galactooligosaccharides（GOSs）with probiotic function through transgalactosylation reaction.In this paper,Lactobacillus plantarum K2,which could highly produce β-galactosidase,was screened from eight strains of Lactobacillus plantarum.The specific activity of βgalactosidase could reach up to 6620 U/g protein and its enzymatic properties were studied.The results indicated that both of the optimum and most stable pH were 6.5 and the optimum temperature was 60℃while the thermostability was best at 40℃.Mg2+ions could enhance the activity of β-galactosidase obviously,while Cu2+ions had a strong effect of inhibition.The Kmand Vmaxvalues for oNPG were 1.15 mmol/L and 6.34 μmol/（min·mg）,respectively.These results lay a foundation for the development of microecologics of Lactobacillus plantarum,which have the ability to solve the problem of lactose intolerance.

β-galactosidase；Lactobacillus plantarum；enzymatic properties

Q936

A

1001-2230（2012）09-0008-03

2012-01-13

谷月華（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锓肿由飳W(xué)。

郝彥玲