乳腺癌組織MT1-MMP表達與淋巴管生成的關系*

姚廣裕，何 萍，楊名添，劉民鋒，葉長生△

(1.南方醫科大學南方醫院乳腺中心，廣州 510515；2.廣州醫學院第一附屬醫院病理科，廣州510120；3.中山大學附屬腫瘤醫院乳腺科，廣州 510515)

盡管淋巴道轉移是乳腺癌最常見的轉移途徑之一，但是，淋巴道轉移的機制目前還未完全清楚。近來，腫瘤新生淋巴管的發現使人們對乳腺癌淋巴道轉移的機制有了新的認識——腫瘤的新生淋巴管在腫瘤的淋巴道轉移中可能起著主導的作用[1]?，F在研究認為，乳腺癌組織內新的淋巴管主要是腫瘤細胞分泌的血管內皮生長因子C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)誘導形成的[2]。但由于缺乏淋巴管特異性標記物，對腫瘤淋巴管的研究相對緩慢。單克隆抗體D2-40是新近發現的淋巴管內皮細胞特異性標記物，可以用于觀察乳腺癌的新生淋巴管[3]。另外，Boardman和Swartz[4]在實驗中發現，在淋巴管形成過程中，淋巴管將要延伸的下游位置膠原發生降解，他認為膠原溶解的主要酶類是基質金屬蛋白酶。本文擬通過分析基質金屬蛋白酶中最重要的成員之一——膜型基質金屬蛋白酶-1(membrane type-1 MMP,MT1-MMP)與VEGF-C、淋巴管密度的關系，提供MT1-MMP參與乳腺癌淋巴管生成的證據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集南方醫科大學南方醫院2009年10月至2011年1月收治的乳腺癌患者87例。所有患者均為女性，中位年齡47歲。根據患者臨床狀況行乳腺癌改良根治術、乳腺癌保留乳房手術，均有完整的術后病理資料。

1.2方法 免疫組化所用的MT1-MMP和VEGF-C一抗為NeoMarkers公司的兔抗人單克隆抗體，D2-40一抗為杭州華安生物技術有限公司即用型鼠抗人單克隆抗體，二抗試劑盒為福建邁新公司的SP超敏試劑盒。

所有標本均經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續切片，行病理常規染色檢查及免疫組化研究。免疫組化染色采用SP法，抗原經高壓修復，實驗步驟按照試劑盒說明書操作，以PBS代替一抗作為陰性對照。

免疫組織化學檢測結果判斷：MT1-MMP免疫組化陽性染色為棕黃色顆粒，位于腫瘤細胞胞膜；VEGF-C陽性顆粒呈棕黃色，位于腫瘤細胞胞質。每張切片隨機選取5個高倍視野，按陽性細胞所占百分比評分，定義陽性細胞大于10%者為陽性病例，陽性細胞小于10%者為陰性病例。

標記微淋巴管密度(LMVD)判定采用Choi等[5]報道的方法：D2-40染色呈陽性染色的單個內皮細胞或內皮細胞簇分別計為一個陽性微淋巴管，管腔大于8個紅細胞直徑或有血管平滑肌的管狀結構不計入內。乳腺癌組織先在低倍鏡(×40)視野下分別選取腫瘤邊緣和腫瘤中心區中脈管最豐富的兩個區域即“熱點”，再在高倍鏡(×400)下分別計數微淋巴管數目，每例計數3個視野，取其均值作為LMVD。

1.3統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件進行分析處理，計數資料分析采用χ2檢驗，計量資料分析采用t檢驗，相關性分析采用Pearson檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1MT1-MMP、VEGF-C、D2-40在乳腺癌組織中的表達 采用免疫組化方法檢測乳腺癌組織中MT1-MMP蛋白的表達，其陽性率為56.3%，陽性染色定位于腫瘤細胞(封2圖1)。VEGF-C陽性率為67.8%，顆粒呈棕黃色，位于腫瘤細胞胞質(封2圖2)。87例乳腺癌組織中均可看到不同程度的D2-40陽性表達，陽性染色定位于淋巴管內皮細胞胞質和(或)胞漿并呈棕黃色顆粒(封2圖3)。

2.2MT1-MMP、VEGF-C、LMVD與乳腺癌腋窩淋巴結轉移的關系 MT1-MMP陰性的患者，腋窩淋巴結轉移率為59.5%，而MT1-MMP陽性的患者腋窩淋巴結轉移率為82.0%，差異有統計學意義(P=0.025)，二者的相關系數為0.3(P=0.005)。VEGF-C陰性的患者，腋窩淋巴結轉移率為46.4%，而VEGF-C陽性的患者腋窩淋巴結轉移率為84.7%，差異有統計學意義(P=0.002)，二者的相關系數為0.394(P=0.000)。而且由表1也可以看出，隨著腋窩淋巴結數目轉移增多，腫瘤的淋巴管密度也明顯增加(P=0.000)。

表1 MT1-MMP、VEGF-C、LMVD與乳腺癌腋窩淋巴結轉移的關系

2.3MT1-MMP與VEGF-C、LMVD的關系 免疫組化結果顯示，MT1-MMP陽性的患者中VEGF-C的陽性率為86.0%，而MT1-MMP陰性的患者中VEGF-C的陽性率為43.2%，差異有統計學意義(P=0.000)，二者的相關系數為0.452(P=0.000)。MT1-MMP陽性的患者中LMVD的平均值為30.2個，而MT1-MMP陰性的患者中LMVD的平均值為25.1個，差異有統計學意義(P=0.000)，二者的相關系數為0.368(P=0.000)，見表2。

表2 MT1-MMP與VEGF-C、D2-40的關系

3 討 論

基礎和臨床研究都表明，腫瘤新生淋巴管是促進乳腺癌癌細胞淋巴道轉移的主要因素[6-7]。目前研究表明，腫瘤促使淋巴管新生是腫瘤細胞分泌的生長因子調控的，主要是VEGF-C。VEGF-C與淋巴上皮細胞表面的受體VEGFR3結合后，通過酪氨酸激酶信號系統發揮作用，促進淋巴管上皮的增生、遷移和新的淋巴管形成[8-9]。目前，很多研究都顯示無論是乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌還是胃癌、食道癌和大腸癌，腫瘤內新生淋巴管標記物的表達都與淋巴結轉移相關[6-7，10-13]。本研究也提示，乳腺癌中腫瘤細胞VEGF-C的表達與腋窩淋巴結轉移呈正相關。

然而，VEGF-C的作用是使腫瘤周圍已經存在的淋巴管上皮增生、出芽、形成管狀結構。但是，新生的淋巴管如何同周圍基質構建成新的組織，并最終使新生淋巴管成為腫瘤內間質的組成部分呢？這就涉及基質的降解和重建，目前在新生淋巴管的研究中，對于基質的變化關注尚不多見。

基質降解和重建首先是一個基質組分的酶解過程，參與這一過程的主要酶類是基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)，其中MT1-MMP在腫瘤基質代謝中的作用最受關注。MT1-MMP通過跨膜結構域固定于細胞膜表面發揮作用，不僅可以直接降解諸如膠原、纖維結合蛋白等基質組分，而且可以激活MMP-2降解多種基質成分。在實驗中還證實，MT1-MMP降解基質主要是通過后一種機制[14]。

那么，MT1-MMP是否參與乳腺癌淋巴管新生過程呢？本研究從免疫組化的層面分析了這一關系。研究發現，免疫組化結果顯示，MT1-MMP陽性的患者中VEGF-C的陽性率明顯高于MT1-MMP陰性的患者(86.0%vs43.2%，P=0.000)。MT1-MMP陽性的患者中LMVD的平均值明顯高于MT1-MMP陰性的患者(30.2個vs25.1個，P=0.000)。這一結果說明，在LMVD高的腫瘤中，即在新生淋巴管活躍的腫瘤中，不僅VEGF-C表達高，而且MT1-MMP表達也高。這就提示，MT1-MMP參與了新生淋巴管的生成過程。

目前，國內外關于MT1-MMP是否參與乳腺癌淋巴管新生過程僅在Nisato等[15]的研究中稍有暗示，他們在體外淋巴上皮三維培養過程中，可以檢測到MT1-MMP mRNA的表達增加。但是，Nisato等[15]研究并非設計研究MT1-MMP與乳腺癌新生淋巴管的關系，因此，尚不足以回答MT1-MMP是否參與新生淋巴管的生成過程這個問題。但是，可以推測，在惡性腫瘤淋巴道轉移過程中，腫瘤細胞可以同時促進VEGF-C和MT1-MMP的表達，此時VEGF-C可以促進淋巴管上皮的增生、遷移，而MT1-MMP則通過降解腫瘤周圍的間質，為新的淋巴管延伸清除基質屏障，從而共同促進新生淋巴管形成，促使腫瘤細胞轉移。

惡性腫瘤的浸潤和轉移是一個非常復雜的過程。本研究從免疫組化著手，初步探討MT1-MMP與淋巴管生成的關系。今后的研究應更加深入的研究MT1-MMP和VEGF-C的關系以及MT1-MMP參與腫瘤淋巴管生成的機制。

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