家兔C型利鈉肽基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定*

張 劍，龔昆梅，肖 樂，王昆華，歐陽一鳴，李臨海，黃映光，朱 宇，龍亞新

(云南省第一人民醫(yī)院普外一科，昆明 650032)

C型利鈉肽(C-type natriuretic peptide,CNP)是Sudoh等[1]在1990年從豬腦中分離而得的由22個(gè)氨基酸組成的多肽，是利鈉肽家族的重要成員[2]，主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血管內(nèi)皮細(xì)胞。目前認(rèn)為CNP是新型有效的血管調(diào)節(jié)因子[3]，但由于CNP在合成后并非大量釋放入血，且半衰期極短(僅為2.6 min)，生理狀態(tài)下血漿CNP濃度難以檢出[4]，大大限制了對其功能的研究和應(yīng)用。本研究利用基因工程技術(shù)將CNP基因?qū)胝婧吮磉_(dá)載體中，是進(jìn)一步基因治療研究的重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒和菌株 真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1由本室保存；感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；克隆載體pMD 18-T購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2主要試劑和工具酶 限制性內(nèi)切酶PstⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、T4DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV購自加拿大Fermentas公司；TaqPlus DNA聚合酶、dNTP Mix、總RNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取純化試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司。

1.1.3PCR引物設(shè)計(jì) 利用軟件Primer Premier 5.0輔助設(shè)計(jì)，由上海超世生物科技有限公司合成。序列如下：上游引物5′-ATG CAC CTC TCC CAG CTG C-3′，5端從起始密碼ATG開始；下游引物5′-ACA TCC CAT GCC GCT CAT G-3′，5′端含有終止密碼子TAG的互補(bǔ)序列。PCR產(chǎn)物長度為381 bp。

1.2方法

1.2.1兔腹主動(dòng)脈總RNA的提取和cDNA的逆轉(zhuǎn)錄 按照總RNA提取試劑盒、Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2兔CNP基因全長編碼區(qū)的克隆 以兔腹主動(dòng)脈cDNA為模板，用RT-PCR方法克隆。cDNA模板4 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，Taq plus buffer(10×)5 μL，Taq plus(5 μ/μL)2 μL，DMSO 2.5 μL，甘油2.5 μL，上游引物(10 μmol/L)2 μL，下游引物(10 μmol/L)2 μL，ddH2O 28 μL。循環(huán)條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 75 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s(共40個(gè)循環(huán))，72 ℃延伸10 min。將產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.3pMD 18-T/rCNP的亞克隆 將CNP片段膠回收后通過TA克隆連接到克隆質(zhì)粒pMD 18-T的TA克隆位點(diǎn)，經(jīng)T/A連接，16 ℃延伸30 min。將重組克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，通過藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆，擴(kuò)增后提取純化質(zhì)粒，得到重組pMD 18-T /rCNP。

1.2.4pMD 18-T/rCNP的篩選和鑒定 用Pst Ⅰ內(nèi)切酶對重組pMD 18-T/rCNP進(jìn)行單酶切，篩選出負(fù)向插入片段，分別用HindⅢ和KpnⅠ雙酶切鑒定。雙酶切體系：10×M Buffer 5 μL，HindⅢ 2.5 μL，KpnⅠ 2.5 μL，模板20 μL，雙蒸20 μL，共50 μL，37 ℃酶切1 h，結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5pEGFP-N1/rCNP的構(gòu)建和鑒定 用HindⅢ和KpnⅠ分別對pEGFP-N1和負(fù)向pMD 18-T/rCNP進(jìn)行雙酶切，切膠回收后將CNP通過T4DNA連接酶定向克隆至pEGFP-N1的酶切位點(diǎn)HindⅢ和KpnⅠ中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，選取陽性克隆，擴(kuò)增后提取純化質(zhì)粒，得到重組pEGFP-N1/rCNP。然后分別用PCR、雙酶切和測序三重方法對重組pEGFP-N1/rCNP進(jìn)行鑒定。

2 結(jié) 果

2.1家兔CNP基因全長編碼區(qū)的克隆 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在381 bp左右的位置可見1條清晰明亮的目的條帶，片段大小與Genebank中公布的片段大小相符。而陰性對照無目的條帶出現(xiàn)，見圖1。

1：DNA 標(biāo)記物；2：目的條帶家兔CNP；3：陰性對照。

2.2pMD 18-T/rCNP亞克隆的篩選和鑒定 用Pst Ⅰ對pMD 18-T /rCNP進(jìn)行單酶切，含反向插入片段的酶切結(jié)果是2條分別為153 bp和2 920 bp的條帶，含正向插入片段的酶切結(jié)果是2條分別為256 bp和2 817 bp的條帶。

1：DNA 標(biāo)記物；2：重組pEGFP-N1/CNP；3：空pEGFP-N1。

2.3pEGFP-N1/rCNP的鑒定 采用pEGFP-N1/rCNP為模板，進(jìn)行PCR鑒定，在381 bp左右的位置可見到目的條帶。用HindⅢ和KpnⅠ對重組pEGFP-N1/rCNP進(jìn)行雙酶切，結(jié)果得到大小分別為4 300 bp和400 bp的2條片段，而空pEGFP-N1僅為1條4 700 bp的片段(圖2)。經(jīng)Blast對比，測序結(jié)果與Genebank中公布的序列完全相符(Gene ID：100344147)，且目的片段被準(zhǔn)確插入到pEGFP-N1中HindⅢ和KpnⅠ中(上海生工生物工程技術(shù)有限公司，07051844(ZJ1)PEGFPN5_A11)。重組pEGFP-N1/rCNP的部分測序結(jié)果，見封2圖3。

3 討 論

利鈉肽家族成員包括心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)，腦利鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、CNP、樹眼鏡蛇屬利鈉肽(dendroaspis natriureticpeptide,DNP)、尿擴(kuò)張素、鳥苷蛋白和尿鳥苷蛋白等[5]。利鈉肽在調(diào)節(jié)血容量、血管平滑肌張力和維持心血管動(dòng)態(tài)平衡方面起著重要作用[6]。其中，ANP和BNP主要來源于心臟，合成后分泌到血液循環(huán)中與血管組織、腎臟和腎上腺上的特異性受體(natriuretic peptide receptor,NPR)-A結(jié)合，發(fā)揮促使血管擴(kuò)張、促進(jìn)利鈉、利尿等作用[7]；CNP主要來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血管內(nèi)皮和腎臟，通過旁分泌、自分泌的方式與NPR-B結(jié)合，對血管緊張度和重構(gòu)起調(diào)節(jié)作用[8-9]。

CNP主要在血管組織中表達(dá)，與廣泛分布于血管系統(tǒng)、腦、骨等組織的受體胞外區(qū)域特異性結(jié)合后，通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)激活與質(zhì)膜相連的鳥苷酸環(huán)化酶，促進(jìn)第二信使cGMP積累，導(dǎo)致cGMP依賴蛋白激酶磷酸化，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，使血管平滑肌松弛[10]。其生理效應(yīng)：(1)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞緊張度與血管內(nèi)皮細(xì)胞保持一致，實(shí)現(xiàn)對局部血管舒縮的調(diào)控[11]；(2)調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)[12]，直接或間接調(diào)節(jié)血壓[3,13]；(3)增強(qiáng)心肌收縮[14]；(4)抑制血管炎癥反應(yīng)和血管平滑肌細(xì)胞增殖[15]；(5)促進(jìn)血管損傷后新生內(nèi)膜形成[3,16]；(6)抑制缺血或再灌注損傷[4]以及作為血管內(nèi)皮細(xì)胞超極化因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor,EDHF)發(fā)揮作用[17]。

本研究直接通過RT-PCR方法從家兔血管組織中克隆CNP全長編碼區(qū)，然而CNP編碼區(qū)GC含量高達(dá)64％，容易形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，使PCR反應(yīng)及測序常常不能順利進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)中采用提高預(yù)變性溫度和延長變性時(shí)間的辦法，同時(shí)加入甘油和二甲亞砜等PCR增強(qiáng)劑，保證了PCR擴(kuò)增反應(yīng)的順利進(jìn)行。

外源DNA片段與載體連接的方式包括同源黏端連接、平端連接和定向克隆，其中定向克隆具有連接效率高、定向插入和有效限制自身環(huán)化的優(yōu)點(diǎn)[18]。本研究先將CNP全長編碼區(qū)亞克隆至克隆載體pMD 18-T中，再通過雙酶切使CNP片段具備與pEGFP-N1互補(bǔ)的黏端，然后再定向克隆至pEGFP-N1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游。此方法與直接在引物末端添加酶切位點(diǎn)相比，大大提高了酶切和連接效率。

本研究成功構(gòu)建了含家兔CNP基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，對于進(jìn)一步開展研究CNP的作用機(jī)制以及與疾病的關(guān)系及其臨床應(yīng)用價(jià)值等打下了重要基礎(chǔ)。

[1]Sudoh T,Minamino N,Kangawa K,et al.C-type natriuretic peptide(CNP):a new member of natriuretic peptide family identified in porcine brain [J].Biochem Biophys Res Commun,1990，168(2):863-870.

[2]Rubattu S,Sciarretta S,Valenti V,et al.Natriuretic peptides:an update on bioactivity,potential therapeutic use,and implication in cardiovascular diseases[J].Am J Hypertens,2008，21(7):733- 741.

[3]Scotland RS,Ahluwalia A,Hobbs AJ.C-type natriuretic peptide in vascular physiology and disease[J].Pharmacol Ther,2005,105(2):85-93.

[4]Hobbs AJ,Foster P,Prescott C,et al.Natriuretic peptide receptor-C regulates coronary blood flow and prevents myocardial is chemia/reperfusion injury:a novel cardioprotective role for endothelium-derived C-type natriuretic peptide[J].Circulation,2004,110(11):1231-1235.

[5]Potter LR,Yoder AR,Flora DR,et al.Natriuretic peptides:their structures receptors,physiologic,functions and therapeutic applications[J].Handb Exp Pharmacol,2009(191):341-366.

[6]Vlachopoulos C,Ioakeimidis N,Terentes-Printzios D,et al.Amino-terminal pro-C-type natriuretic peptide is associated with arterial stiffness,endothelialfunction and early atherosclerosis[J].Atherosclerosis,2010,211(2):649-655.

[7]Nakao K,Ogawa Y,Suga S,et al.Molecular biology and biochemistry of the natriuretic peptide system.I:Natriuretic peptides[J].J Hypertens,1992,10(9):907-912.

[8]Miyoshi M,Kitaqawa Y,Imoto T,et al.Effect of natriuretic peptide receptor antagonist on lipopolysaccharide-induced fever in rats:is natriuretic peptide an endogenous antipyretic[J].J Pharmacol Exp Ther,2006,318(3):1163-1170.

[9]Pagel-Langenickel I,Buttgereit J,Bader M,et al.Natriuretic peptide receptor B signaling in the cardiovascular system:protection from cardiac hypertrophy[J].J Mol Med(Berl),2007,85(8):797-810.

[10]Garbers DL,Chrisman TD,Wiegn P,et al.Membrane guanylyl cyclase receptors:an update[J].Trend s Endocrinol Metab,2006,17(6):251-258.

[11]Kelsall CJ,Chester AH,Sarathchandra P,et al.Expression and localization of C-type natriuretic peptide in human vascular smooth muscle cells[J].Vascular Pharmacol,2006,45(6):368-373.

[12]Potter LR,Abbey-Hosch S,Dickey DM.Natriuretic peptides,their receptors,and cyclic guanosine monophosphate-dependent signaling functions[J].Endocr Rev,2006,27(1):47-72.

[13]Ono K,Mannami T,Baba S,et al.A single-nucleotide polymorphism in C-type natriuretic peptide gene may be associated with hypertension[J].Hypertens Res,2002,25(5):727-730.

[14]Palmer SC,Prickett TC,Espiner EA,et al.Regional release and clearance of C-type natriuretic peptides in the human circulation and relation to cardiac function[J].Hypertension,2009,54(3):612-618.

[15]Walther T,Stepan H.C-type natriuretic peptide in reproduction,pregnancy and fetal development[J].J Endocrinol,2004,180(1):17-22.

[16]Hutchinson H,Trinlade P,Cunanan D,et al.Mechanisms of natriuretic-peptide-induced growth inhibition of vascular smooth muscle cells[J].Cardiovascular Res,1997,35(1):158-167.

[17]Sandow SL,Tare M.C-type natriuretic peptide:a new endothelium-derived hyperpolarizing factor[J].Trends Pharmacol Sci,2007,28(2):61-67.

[18]Sambrook J,Ffitsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual[M].3rd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor,2002:78-90.